Ang Alzheimer's disease (AD) kulang sa mga biomarker sa protina nga nagpakita sa daghang nagpahiping pathophysiology niini, nga nakababag sa pag-uswag sa diagnosis ug pagtambal. Dinhi, gigamit namon ang komprehensibo nga mga proteomic aron mahibal-an ang mga biomarker sa cerebrospinal fluid (CSF) nga nagrepresentar sa usa ka halapad nga sakup sa AD pathophysiology. Ang multiplex mass spectrometry nagpaila sa gibana-bana nga 3,500 ug gibana-bana nga 12,000 nga mga protina sa AD CSF ug sa utok, matag usa. Ang pagtuki sa network sa utok nga proteome nakasulbad sa 44 biodiversity modules, 15 niini nagsapaw sa cerebrospinal fluid proteome. Ang mga marka sa CSF AD niining mga nagsapaw-sapaw nga mga module gipilo ngadto sa lima ka grupo sa protina, nga nagrepresentar sa lain-laing mga proseso sa pathophysiological. Ang mga synapses ug metabolites sa AD utok mikunhod, apan ang CSF nagdugang, samtang ang glial-rich myelination ug immune nga mga grupo sa utok ug CSF nagdugang. Ang pagkamakanunayon ug espesipiko sa sakit sa mga pagbag-o sa panel gikumpirma sa labaw pa sa 500 nga dugang nga mga sample sa CSF. Kini nga mga grupo usab nagpaila sa mga biolohikal nga subgroup sa asymptomatic AD. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta usa ka maayong lakang padulong sa mga gamit sa biomarker nga nakabase sa web alang sa mga klinikal nga aplikasyon sa AD.
Ang Alzheimer's disease (AD) mao ang labing kasagarang hinungdan sa neurodegenerative dementia sa tibuok kalibutan ug gihulagway sa usa ka halapad nga mga biological system dysfunctions, lakip ang synaptic transmission, glial-mediated immunity, ug mitochondrial metabolism (1-3). Bisan pa, ang natukod nga mga biomarker sa protina nagpunting gihapon sa pag-ila sa amyloid ug tau nga protina, ug busa dili makapakita niining lainlaing pathophysiology. Kining "kinauyokan" nga mga biomarker sa protina nga labing kasaligan nga gisukod sa cerebrospinal fluid (CSF) naglakip sa (i) amyloid beta peptide 1-42 (Aβ1-42), nga nagpakita sa pagporma sa cortical amyloid plaques; (ii) total tau, usa ka timaan sa pagkadaot sa axon; (iii) phospho-tau (p-tau), usa ka representante sa pathological tau hyperphosphorylation (4-7). Bisan kung kini nga mga biomarker sa cerebrospinal fluid labi nga nagpadali sa among pag-ila sa "gimarkahan" nga mga sakit sa protina sa AD (4-7), kini nagrepresentar lamang sa usa ka gamay nga bahin sa komplikado nga biology luyo sa sakit.
Ang kakulang sa pathophysiological diversity sa AD biomarkers misangpot sa daghang mga hagit, lakip ang (i) ang kawalay katakus sa pag-ila ug pag-ihap sa biological heterogeneity sa mga pasyente sa AD, (ii) dili igo nga pagsukod sa kagrabe ug pag-uswag sa sakit, ilabi na sa preclinical stage, Ug ( iii) ang pag-uswag sa mga tambal nga therapeutic nga napakyas sa hingpit nga pagsulbad sa tanan nga mga aspeto sa pagkadaot sa neurological. Ang among pagsalig sa landmark nga patolohiya aron ihulagway ang AD gikan sa mga may kalabutan nga mga sakit nagpasamot lamang niini nga mga problema. Nagkadaghan ang mga ebidensya nga nagpakita nga kadaghanan sa mga tigulang nga adunay dementia adunay labaw sa usa ka pathological nga kinaiya sa pagkunhod sa panghunahuna (8). Mokabat sa 90% o labaw pa sa mga indibidwal nga adunay AD pathology usab adunay sakit sa vascular, TDP-43 inclusions, o uban pang degenerative nga mga sakit (9). Kining taas nga proporsiyon sa pathological overlap nakabalda sa atong kasamtangan nga diagnostic framework alang sa dementia, ug gikinahanglan ang mas komprehensibo nga pathophysiological definition sa sakit.
Tungod sa dinalian nga panginahanglan alang sa lainlaing mga biomarker sa AD, ang natad labi nga nagsagop sa pamaagi nga "omics" nga gibase sa kinatibuk-ang sistema aron madiskubre ang mga biomarker. Ang Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance gilunsad sa 2014 ug mao ang nag-una sa programa. Kini nga multidisciplinary nga paningkamot sa National Institutes of Health, academia, ug industriya nagtumong sa paggamit sa mga estratehiya nga nakabase sa sistema aron mas maayo nga mahibal-an ang pathophysiology sa AD ug mapalambo ang biodiversity diagnostic analysis ug mga estratehiya sa pagtambal (10). Isip kabahin niini nga proyekto, ang network proteomics nahimong usa ka promising tool alang sa pag-uswag sa system-based biomarkers sa AD. Kini nga walay pagpihig nga data-driven nga pamaagi nag-organisar sa komplikadong proteomics data sets ngadto sa mga grupo o "modules" sa co-expressed nga mga protina nga nalangkit sa piho nga mga tipo sa selula, organelles, ug biological functions (11-13). Halos 12 ka mga pagtuon sa network proteomics nga puno sa impormasyon ang gihimo sa utok sa AD (13-23). Sa kinatibuk-an, kini nga mga pag-analisar nagpakita nga ang AD utok network proteome nagmintinar sa usa ka kaayo conserved modular nga organisasyon sa independenteng cohorts ug daghang cortical rehiyon. Dugang pa, ang pipila niini nga mga module nagpakita sa mabag-o nga mga pagbag-o sa AD-related nga kadagaya sa mga set sa datos, nga nagpakita sa pathophysiology sa daghang mga sakit. Sa kinatibuk-an, kini nga mga nahibal-an nagpakita sa usa ka maayong punto sa angkla alang sa pagkadiskobre sa proteome sa network sa utok isip usa ka biomarker nga nakabase sa sistema sa AD.
Aron mabag-o ang proteome sa network sa utok sa AD nga mahimong mapuslanon nga mga biomarker nga nakabase sa sistema sa klinika, gihiusa namon ang network nga nakuha sa utok nga adunay pag-analisa sa proteomic sa AD CSF. Kini nga integrated nga pamaagi misangpot sa pag-ila sa lima ka promising sets sa CSF biomarkers nga nalangkit sa usa ka halapad nga han-ay sa utok-based pathophysiology, lakip na ang mga synapses, blood vessels, myelination, panghubag, ug dysfunction sa metabolic pathways. Malampuson namon nga gi-validate kini nga mga panel sa biomarker pinaagi sa daghang pag-analisar sa replikasyon, lakip ang labaw sa 500 nga mga sample sa CSF gikan sa lainlaing mga sakit nga neurodegenerative. Kini nga mga pag-analisar sa validation naglakip sa pagsusi sa mga target sa grupo sa CSF sa mga pasyente nga adunay asymptomatic AD (AsymAD) o nagpakita sa ebidensya sa abnormal nga amyloid accumulation sa normal nga cognitive environment. Kini nga mga pag-analisar nagpasiugda sa mahinungdanon nga biolohikal nga heterogeneity sa populasyon sa AsymAD ug nagpaila sa mga marker sa panel nga mahimong makahimo sa pag-subtype sa mga indibidwal sa pinakaunang yugto sa sakit. Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagrepresentar sa usa ka yawe nga lakang sa pagpauswag sa mga himan sa biomarker sa protina base sa daghang mga sistema nga malampuson nga makasulbad sa daghang mga hagit sa klinikal nga giatubang sa AD.
Ang panguna nga katuyoan niini nga pagtuon mao ang pag-ila sa bag-ong mga biomarker sa cerebrospinal fluid nga nagpakita sa lainlaing pathophysiology nga nakabase sa utok nga nagdala sa AD. Ang Figure S1 naglatid sa among pamaagi sa pagpanukiduki, nga naglakip sa (i) usa ka komprehensibo nga pag-analisa nga gimaneho sa pasiuna nga mga nahibal-an sa AD CSF ug ang network sa utok nga proteome aron mahibal-an ang daghang mga biomarker sa sakit nga CSF nga may kalabutan sa utok, ug (ii) sunod-sunod nga pagkopya Kini nga mga biomarker naa sa daghang independente nga cerebrospinal. fluid cohorts. Ang panukiduki nga gitun-an sa pagkadiskobre nagsugod sa pagtuki sa kalainan sa ekspresyon sa CSF sa 20 ka normal nga mga indibidwal ug 20 ka mga pasyente sa AD sa Emory Goizueta Alzheimer's Disease Research Center (ADRC). Ang diagnosis sa AD gihubit isip usa ka mahinungdanong pagkadaot sa panghunahuna sa presensya sa ubos nga Aβ1-42 ug taas nga lebel sa total tau ug p-tau sa cerebrospinal fluid [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Table S1A). Ang kontrol (nagpasabot nga MoCA, 26.7 ± 2.2) adunay normal nga lebel sa mga biomarker sa CSF.
Ang CSF sa tawo gihulagway pinaagi sa usa ka dinamikong hanay sa abunda nga protina, diin ang albumin ug uban pang hilabihan ka daghan nga mga protina makapugong sa pagkakita sa mga protina nga interesado (24). Aron madugangan ang giladmon sa pagkadiskobre sa protina, gikuha namo ang unang 14 nga daghan kaayong protina gikan sa matag sample sa CSF sa wala pa ang mass spectrometry (MS) analysis (24). Usa ka kinatibuk-an nga 39,805 nga mga peptide ang giila sa MS, nga gimapa sa 3691 nga mga proteome sa 40 nga mga sample. Ang pag-ihap sa protina gihimo pinaagi sa daghang tandem mass tag (TMT) nga pag-label (18, 25). Aron masulbad ang nawala nga datos, among gilakip lamang ang mga protina nga gi-quantified sa labing menos 50% sa mga sample sa sunod nga pag-analisar, sa ingon sa katapusan nag-ihap sa 2875 nga mga proteome. Tungod sa mahinungdanong kalainan sa kinatibuk-ang lebel sa kaabunda sa protina, ang usa ka sampol nga kontrol gikonsiderar nga estadistika nga outlier (13) ug wala gilakip sa sunod nga pagtuki. Ang kadagaya nga kantidad sa nahabilin nga 39 nga mga sample gi-adjust sumala sa edad, gender, ug batch covariance (13-15, 17, 18, 20, 26).
Gigamit ang statistical t-test analysis aron sa pagtimbang-timbang sa differential expression sa regression data set, kini nga pag-analisa nagpaila sa mga protina kansang mga lebel sa kadagaya nausab pag-ayo (P <0.05) tali sa kontrol ug AD nga mga kaso (Table S2A). Ingon sa gipakita sa Figure 1A, ang kadagaya sa usa ka kinatibuk-an nga 225 nga mga protina sa AD mikunhod pag-ayo, ug ang kadagaya sa 303 nga mga protina nadugangan pag-ayo. Kini nga mga lahi nga gipahayag nga mga protina naglakip sa ubay-ubay nga giila kaniadto nga cerebrospinal fluid AD marker, sama sa microtubule-associated protein tau (MAPT; P = 3.52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protein nga may kalabutan sa pagtubo 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Fatty Acid Binding Protein 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 sama sa 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10-4) ug VGF nerve growth factor (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Bisan pa, nahibal-an usab namon ang uban pang hinungdanon nga mga target, sama sa GDP dissociation inhibitor 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) ug modular calcium binding nga may kalabotan sa SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Ang pag-analisa sa Gene Ontology (GO) sa 225 nga hinungdanon nga pagkunhod sa mga protina nagpadayag sa suod nga koneksyon sa mga proseso sa likido sa lawas sama sa metabolismo sa steroid, coagulation sa dugo, ug kalihokan sa hormone (Figure 1B ug Table S2B). Sa kasukwahi, ang kamahinungdanon nga pagtaas sa protina sa 303 suod nga nalangkit sa istruktura sa selula ug metabolismo sa enerhiya.
(A) Ang plot sa bulkan nagpakita sa log2 fold change (x-axis) kalabot sa -log10 statistical P value (y-axis) nga nakuha sa t-test, nga gigamit sa pag-detect sa differential expression tali sa control (CT) ug AD nga mga kaso sa CSF proteome Sa tanan nga mga protina. Ang mga protina nga adunay daghang pagkunhod sa lebel (P <0.05) sa AD gipakita sa asul, samtang ang mga protina nga adunay daghang pagtaas sa lebel sa sakit gipakita sa pula. Ang pinili nga protina gimarkahan. (B) Ang nag-una nga mga termino sa GO nga may kalabutan sa protina labi nga pagkunhod (asul) ug pagtaas (pula) sa AD. Nagpakita sa tulo ka termino sa GO nga adunay pinakataas nga z-scores sa natad sa biological nga mga proseso, molecular functions, ug cellular components. (C) Gisukod sa MS ang lebel sa MAPT sa sample sa CSF (wala) ug ang correlation niini sa sample nga lebel sa ELISA tau (tuo). Ang Pearson correlation coefficient uban sa may kalabutan nga P value gipakita. Tungod sa kakulang sa datos sa ELISA alang sa usa ka kaso sa AD, kini nga mga numero naglakip sa mga kantidad alang sa 38 sa 39 nga gisusi nga mga kaso. (D) Supervised cluster analysis (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) adjust P <0.01) sa control ug AD CSF nakit-an nga mga sample gamit ang 65 nga labing hinungdanon nga nabag-o nga mga protina sa set sa datos. I-standardize, i-normalize.
Ang lebel sa proteomic sa MAPT suod nga may kalabutan sa independente nga gisukod nga lebel sa ELISA tau (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Figure 1C), nga nagsuporta sa pagkabalido sa among pagsukod sa MS. Human sa pagtunaw sa trypsin sa lebel sa amyloid precursor protein (APP), ang isoform-specific peptides nga gimapa ngadto sa C-terminus sa Aβ1-40 ug Aβ1-42 dili mahimong ionized nga episyente (27, 28). Busa, ang mga peptide sa APP nga among giila walay kalabotan sa lebel sa ELISA Aβ1-42. Aron sa pagtimbang-timbang sa differential ekspresyon sa matag kaso, migamit kami differentially gipahayag protina uban sa P <0.0001 [false discovery rate (FDR) corrected P <0.01] sa pagbuhat sa usa ka supervised cluster analysis sa mga sample (Table S2A). Sama sa gipakita sa Figure 1D, kini nga 65 nga labi ka hinungdanon nga mga protina mahimo nga husto nga pag-cluster sa mga sample sumala sa kahimtang sa sakit, gawas sa usa ka kaso sa AD nga adunay mga kinaiya nga sama sa pagkontrol. Niining 65 ka protina, 63 ang misaka sa AD, samtang duha lang (CD74 ug ISLR) ang mikunhod. Sa kinatibuk-an, kini nga mga pag-analisar sa cerebrospinal fluid nakaila sa gatusan ka mga protina sa AD nga mahimong magsilbi nga biomarker sa sakit.
Dayon naghimo kami og usa ka independenteng pag-analisar sa network sa AD brain proteome. Ang utok nga cohort niini nga pagkadiskobre naglakip sa dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) gikan sa kontrol (n = 10), Parkinson's disease (PD; n = 10), mixed AD / PD (n = 10) ug AD (n = 10) nga mga kaso. ) Sampol. Emery Goizueta ADRC. Ang demograpiko niining 40 ka mga kaso gihulagway na kaniadto (25) ug gisumada sa Talaan S1B. Gigamit namo ang TMT-MS sa pag-analisar niining 40 ka mga tisyu sa utok ug ang replication cohort sa 27 ka mga kaso. Sa kinatibuk-an, kining duha ka mga set sa datos sa utok naghimo og 227,121 nga talagsaon nga mga peptide, nga gi-mapa sa 12,943 nga mga proteome (25). Kadto lamang nga mga protina nga gi-quantified sa labing menos 50% sa mga kaso ang gilakip sa sunod nga mga imbestigasyon. Ang katapusan nga set sa datos sa pagkadiskobre adunay 8817 nga quantified nga mga protina. I-adjust ang lebel sa kadagaya sa protina base sa edad, gender, ug post-mortem interval (PMI). Ang differential expression analysis sa data set human sa regression nagpakita nga> 2000 nga lebel sa protina ang nausab pag-ayo [P <0.05, analysis of variance (ANOVA)] sa duha o labaw pa nga mga cohorts sa sakit. Dayon, naghimo kami og usa ka supervised cluster analysis base sa differentially expressed proteins, ug P <0.0001 sa AD/control ug/o AD/PD comparisons (Figure S2, A and B, Table S2C). Kini nga mga 165 nga gibag-o kaayo nga mga protina tin-aw nga naghulagway sa mga kaso nga adunay AD pathology gikan sa control ug PD sample, nga nagpamatuod sa kusog nga AD-specific nga mga pagbag-o sa tibuok proteome.
Gigamit dayon namo ang usa ka algorithm nga gitawag Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) aron ipahigayon ang pagtuki sa network sa nadiskobrehan nga proteome sa utok, nga nag-organisar sa mga datos nga gibutang sa mga module sa protina nga adunay susama nga mga pattern sa ekspresyon (11-13). Giila sa pag-analisa ang 44 ka modules (M) nga co-expressed nga mga protina, gisunod ug giihap gikan sa pinakadako (M1, n = 1821 nga mga protina) ngadto sa pinakagamay (M44, n = 34 nga mga protina) (Figure 2A ug Table S2D) ). Sama sa gihisgutan sa ibabaw (13) Kalkulahin ang representante nga ekspresyon nga profile o kinaiya nga protina sa matag module, ug i-correlate kini sa kahimtang sa sakit ug AD pathology, nga mao, pagtukod sa alyansa sa Alzheimer's Disease Registry (CERAD) ug Braak Score (Figure 2B). Sa kinatibuk-an, ang mga module sa 17 adunay kalabutan sa AD neuropathology (P <0.05). Daghan niini nga mga modulo nga may kalabutan sa sakit adunahan usab sa mga marka nga piho nga tipo sa selula (Figure 2B). Sama sa gihisgutan sa ibabaw (13), ang pagpauswag sa tipo sa selula gitino pinaagi sa pag-analisar sa module nga nagsapaw ug ang lista sa pakisayran sa mga gene nga piho nga tipo sa cell. Kini nga mga gene nakuha gikan sa gipatik nga datos sa nahilit nga mga neuron sa mouse, endothelial ug glial cells. RNA sequencing (RNA-seq) eksperimento (29).
(A) Hibal-i ang WGCNA sa proteome sa utok. (B) Biweight midcorrelation (BiCor) analysis sa modular signature protein (ang unang mayor nga bahin sa modular protein expression) nga adunay AD neuropathological nga mga kinaiya (ibabaw), lakip ang CERAD (Aβ plaque) ug Braak (tau tangles) nga mga marka. Ang mga intensidad sa positibo (pula) ug negatibo (asul) nga mga correlation gipakita sa usa ka duha ka kolor nga mapa sa kainit, ug ang mga asterisk nagpakita sa istatistikal nga kahulogan (P <0.05). Gamita ang Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (ubos) aron masusi ang tipo sa selula nga asosasyon sa matag module sa protina. Ang intensity sa red shading nagpakita sa ang-ang sa cell type enrichment, ug ang asterisk nagpakita sa statistical significance (P <0.05). Gamita ang pamaagi sa BH aron matul-id ang P value nga nakuha gikan sa FET. (C) pagtuki sa GO sa modular nga mga protina. Ang labing suod nga kalambigitan sa biolohikal nga mga proseso gipakita alang sa matag module o kalambigit nga grupo sa module. oligo, oligodendrocyte.
Usa ka hugpong sa lima ka suod nga may kalabutan nga astrocyte ug microglia-rich modules (M30, M29, M18, M24, ug M5) nagpakita sa usa ka lig-on nga positibo nga correlation sa AD neuropathology (Figure 2B). Ang pag-analisa sa ontolohiya nagsumpay niining mga glial modules sa pagtubo sa selula, pagdaghan, ug resistensya (Figure 2C ug Table S2E). Duha ka dugang nga glial modules, M8 ug M22, kusog usab nga na-upregulate sa sakit. Ang M8 kay may kalabutan kaayo sa Toll-like receptor pathway, usa ka signaling cascade nga adunay importanteng papel sa natural nga immune response (30). Sa samang higayon, ang M22 suod nga nalambigit sa post-translational nga pagbag-o. Ang M2, nga dato sa oligodendrocytes, nagpakita sa usa ka lig-on nga positibo nga correlation sa AD pathology ug usa ka ontological nga koneksyon sa nucleoside synthesis ug DNA replication, nga nagpakita sa gipalambo nga pagdaghan sa selula sa mga sakit. Sa kinatibuk-an, kini nga mga nahibal-an nagsuporta sa elevation sa glial modules nga among naobserbahan kaniadto sa AD network proteome (13, 17). Sa pagkakaron nakit-an nga daghang AD-related glial modules sa network nagpakita sa ubos nga lebel sa ekspresyon sa kontrol ug PD nga mga kaso, nga nagpasiugda sa ilang sakit nga espesipiko nga gipataas sa AD (Figure S2C).
Upat ra ka mga module sa among network proteome (M1, M3, M10, ug M32) ang kusgan nga negatibo nga may kalabotan sa patolohiya sa AD (P <0.05) (Figure 2, B ug C). Ang M1 ug M3 dato sa neuronal marker. Ang M1 adunay kalabutan sa synaptic signal, samtang ang M3 suod nga may kalabutan sa mitochondrial function. Wala’y ebidensya sa pagpauswag sa tipo sa selula alang sa M10 ug M32. Ang M32 nagpakita sa koneksyon tali sa M3 ug metabolismo sa selula, samtang ang M10 adunay kalabutan sa pagtubo sa selula ug pag-obra sa microtubule. Kung itandi sa AD, ang tanan nga upat ka mga module gipataas sa kontrol ug PD, nga naghatag kanila sa mga pagbag-o sa AD nga piho sa sakit (Figure S2C). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagsuporta sa pagkunhod sa kadagaya sa neuron-rich modules nga atong naobserbahan kaniadto sa AD (13, 17). Sa katingbanan, ang pag-analisar sa network sa proteome sa utok nga among nadiskubrehan nagpatunghag mga modulo nga piho nga giusab sa AD nga nahiuyon sa among mga nauna nga nahibal-an.
Ang AD gihulagway sa usa ka sayo nga asymptomatic stage (AsymAD), diin ang mga indibidwal nagpakita sa amyloid accumulation nga walay clinical cognitive nga pagkunhod (5, 31). Kini nga asymptomatic nga yugto nagrepresentar sa usa ka kritikal nga bintana alang sa sayo nga pag-ila ug interbensyon. Gipakita namon kaniadto ang lig-on nga modular nga pagpreserba sa AsymAD ug AD nga proteome sa network sa utok sa mga independente nga set sa datos (13, 17). Aron masiguro nga ang network sa utok nga among nahibal-an karon nahiuyon sa mga nauna nga nahibal-an, among gisusi ang pagpreserbar sa 44 nga mga module sa gisubli nga set sa datos gikan sa 27 nga mga organisasyon sa DLPFC. Kini nga mga organisasyon naglakip sa kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) Ug AD (n = 9) nga mga kaso. Ang control ug AD nga mga sample gilakip sa pag-analisa sa among discovery brain cohort (Table S1B), samtang ang mga kaso sa AsymAD talagsaon lamang sa replication cohort. Kini nga mga kaso sa AsymAD gikan usab sa Emory Goizueta ADRC brain bank. Bisan kung normal ang pag-ila sa panahon sa pagkamatay, ang lebel sa amyloid abnormal kaayo (nagpasabot nga CERAD, 2.8 ± 0.5) (Table S1B).
Ang pag-analisar sa TMT-MS niining 27 nga mga tisyu sa utok miresulta sa pag-ihap sa 11,244 nga mga proteome. Kini nga katapusang ihap naglakip lamang sa mga protina nga gikuwenta sa labing menos 50% sa mga sample. Kini nga gisubli nga set sa datos naglangkob sa 8638 (98.0%) sa 8817 nga mga protina nga nakit-an sa among pagtuki sa utok nga nadiskobrehan, ug adunay hapit 3000 nga hinungdanon nga pagbag-o sa mga protina tali sa control ug AD cohorts (P <0.05, pagkahuman sa gipares nga t test ni Tukey alang sa pagtuki sa kalainan) ( Talaan S2F). Taliwala sa kini nga mga lahi nga gipahayag nga mga protina, ang 910 nagpakita usab nga hinungdanon nga mga pagbag-o sa lebel tali sa AD ug mga kaso sa pagkontrol sa proteome sa utok (P <0.05, pagkahuman sa ANOVA Tukey nga gipares nga t-test). Angay nga matikdan nga kini nga mga marka sa 910 kanunay nga makanunayon sa direksyon sa pagbag-o tali sa mga proteome (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Figure S3A). Taliwala sa nadugangan nga mga protina, ang mga protina nga adunay labing makanunayon nga pagbag-o sa taliwala sa mga set sa datos kasagaran mga miyembro sa glial-rich M5 ug M18 modules (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, ug GFAP). Lakip sa gipakunhod nga mga protina, kadtong adunay labing makanunayon nga pagbag-o halos mga miyembro lamang sa M1 module (NPTX2, VGF, ug RPH3A) nga nalangkit sa synapse. Gipamatud-an pa namon ang mga pagbag-o nga may kalabutan sa AD sa midkine (MDK), CD44, gitago nga frizzled-related nga protina 1 (SFRP1) ug VGF pinaagi sa western blotting (Figure S3B). Ang pag-analisa sa pagpreserba sa module nagpakita nga mga 80% sa mga module sa protina (34/44) sa proteome sa utok ang labi nga gitipig sa set sa datos sa pagkopya (z-score> 1.96, gitul-id sa FDR ang P <0.05) (Figure S3C). Napulog-upat niini nga mga modulo ang espesyal nga gitagana tali sa duha ka proteome (z-score> 10, FDR gitul-id P <1.0 × 10-23). Sa kinatibuk-an, ang pagkadiskobre ug pagkopya sa taas nga lebel sa pagkamakanunayon sa differential expression ug modular nga komposisyon tali sa utok nga proteome nagpasiugda sa reproducibility sa mga kausaban sa AD frontal cortex proteins. Dugang pa, gikumpirma usab niini nga ang AsymAD ug mas abante nga mga sakit adunay parehas nga istruktura sa network sa utok.
Ang usa ka mas detalyado nga pag-analisa sa differential expression sa brain replication data set nagpasiugda sa mahinungdanong ang-ang sa AsymAD nga mga kausaban sa protina, lakip ang total nga 151 nga mahinungdanong nausab nga mga protina tali sa AsymAD ug sa kontrol (P <0.05) (Figure S3D). Nahiuyon sa pagkarga sa amyloid, ang APP sa utok sa AsymAD ug AD miuswag pag-ayo. Ang MAPT nagbag-o lamang pag-ayo sa AD, nga nahiuyon sa pagtaas sa lebel sa mga tangles ug ang nahibal-an nga correlation sa pagkunhod sa cognitive (5, 7). Ang mga modulo nga dato sa glial (M5 ug M18) gipakita kaayo sa pagtaas sa mga protina sa AsymAD, samtang ang modulo nga M1 nga may kalabotan sa neuron mao ang labing representante sa pagkunhod sa mga protina sa AsymAD. Daghan niini nga mga marka sa AsymAD nagpakita sa daghang mga pagbag-o sa mga simtomas nga sakit. Lakip niini nga mga marker mao ang SMOC1, usa ka glial nga protina nga iya sa M18, nga nalangkit sa mga tumor sa utok ug sa pagpalambo sa mga mata ug mga bukton (32). Ang MDK usa ka heparin-binding growth factor nga may kalabutan sa pagtubo sa selula ug angiogenesis (33), laing miyembro sa M18. Kung itandi sa kontrol nga grupo, ang AsymAD miuswag pag-ayo, gisundan sa usa ka mas dako nga pagtaas sa AD. Sa kasukwahi, ang synaptic protein neuropentraxin 2 (NPTX2) gikunhod pag-ayo sa utok sa AsymAD. Ang NPTX2 kaniadto nakig-uban sa neurodegeneration ug adunay usa ka giila nga papel sa pagpataliwala sa excitatory synapses (34). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpadayag sa lain-laing mga lain-laing mga preclinical protina kausaban sa AD nga daw sa pag-uswag uban sa kagrabe sa sakit.
Gihatag nga nakab-ot namon ang usa ka hinungdanon nga giladmon sa pagsakup sa protina sa pagkadiskobre sa proteome sa utok, gipaningkamutan namon nga masabtan ang labi ka hingpit nga pagsapaw niini sa lebel sa network nga AD transcriptome. Busa, among gitandi ang utok nga proteome nga among nadiskobrehan sa module nga among nahimo kaniadto gikan sa microarray nga pagsukod sa 18,204 nga mga gene sa AD (n = 308) ug pagkontrol (n = 157) DLPFC nga mga tisyu (13). nagsapaw. Sa kinatibuk-an, nahibal-an namon ang 20 nga lainlaing mga module sa RNA, nga kadaghanan niini nagpakita sa pagpauswag sa mga piho nga tipo sa cell, lakip ang mga neuron, oligodendrocytes, astrocytes, ug microglia (Figure 3A). Ang daghang mga pagbag-o niini nga mga module sa AD gipakita sa Figure 3B. Nahiuyon sa among miaging protina-RNA overlap analysis gamit ang mas lawom nga unlabeled MS proteome (mga 3000 ka protina) (13), kadaghanan sa 44 nga mga module sa utok nga proteome network nga among nakit-an naa sa transcriptome network Wala’y mahinungdanong overlap sa. Ang among pagkadiskobre ug pagkopya sa 34 nga mga module sa protina nga gitipigan pag-ayo sa proteome sa utok, 14 lamang (~ 40%) ang nakapasar sa eksaktong pagsulay (FET) ni Fisher nga napamatud-an nga adunay usa ka hinungdanon nga istatistika nga nagsapaw sa transcriptome (Figure 3A). Nahiuyon sa pag-ayo sa kadaot sa DNA (P-M25 ug P-M19), paghubad sa protina (P-M7 ug P-M20), RNA binding/splicing (P-M16 ug P-M21) ug pag-target sa protina (P-M13 ug P- M23) wala mag-overlap sa mga module sa transcriptome. Busa, bisan tuod ang usa ka mas lawom nga proteome data set gigamit sa kasamtangan nga overlap analysis (13), kadaghanan sa AD network proteome wala mapa sa transcriptome network.
(A) Ang Hypergeometric FET nagpakita sa pagpalambo sa cell type-specific marker sa RNA module sa AD transcriptome (top) ug ang degree sa overlap tali sa RNA (x-axis) ug protein (y-axis) modules sa AD brain (ubos). Ang intensity sa pula nga shading nagpaila sa ang-ang sa pagpalambo sa mga tipo sa cell sa ibabaw nga panel ug ang intensity sa overlap sa mga modules sa ubos nga panel. Ang mga asterisk nagpakita sa statistical significance (P <0.05). (B) Ang lebel sa correlation tali sa mga kinaiya nga gene sa matag transcriptome module ug AD status. Ang mga module sa wala mao ang labing negatibo nga may kalabutan sa AD (asul), ug ang naa sa tuo mao ang labing positibo nga may kalabutan sa AD (pula). Ang log-transformed BH-corrected P value nagpakita sa ang-ang sa statistical significance sa matag correlation. (C) Mahinungdanon nga nagsapaw-sapaw nga mga module nga adunay gipaambit nga pagpauswag sa tipo sa cell. (D) Correlation analysis sa log2 fold nga pagbag-o sa gimarkahan nga protina (x-axis) ug RNA (y-axis) sa overlapping module. Ang Pearson correlation coefficient uban sa may kalabutan nga P value gipakita. Micro, microglia; celestial nga mga lawas, mga astrocyte. CT, kontrol.
Kadaghanan sa nagsapaw-sapaw nga mga module sa protina ug RNA nag-ambit sa parehas nga mga profile sa pagpaayo sa tipo sa cell ug makanunayon nga direksyon sa pagbag-o sa AD (Figure 3, B ug C). Sa laing pagkasulti, ang synapse-related nga M1 module sa utok nga proteome (PM1) gimapa ngadto sa tulo ka neuronal-rich homologous RNA modules (R-M1, R-M9 ug R-M16), nga anaa sa AD. usa ka pagkunhod sa lebel. Sa susama, ang glial-rich M5 ug M18 protein modules nagsapaw sa RNA modules nga dato sa astrocytes ug microglial marker (R-M3, R-M7, ug R-M10) ug nalambigit pag-ayo sa mga sakit nga Pagtaas. Kini nga gipaambit nga modular nga mga bahin tali sa duha nga mga set sa datos dugang nga nagsuporta sa pagpauswag sa tipo sa cell ug mga pagbag-o nga may kalabutan sa sakit nga among naobserbahan sa proteome sa utok. Bisan pa, naobserbahan namon ang daghang hinungdanon nga mga kalainan tali sa lebel sa RNA ug protina sa mga indibidwal nga marker sa kini nga gipaambit nga mga module. Ang pagtuki sa correlation sa differential expression sa proteomics ug transcriptomics sa mga molekula sulod niining mga overlapping modules (Figure 3D) nagpasiugda niini nga inconsistency. Pananglitan, ang APP ug daghang uban pang mga glial module nga protina (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, ug SFRP1) nagpakita sa usa ka mahinungdanon nga pagtaas sa AD proteome, apan halos walay pagbag-o sa AD transcriptome. Kini nga mga pagbag-o nga espesipiko sa protina mahimong suod nga may kalabutan sa amyloid plaques (23, 35), nga nagpasiugda sa proteome ingon nga gigikanan sa mga pagbag-o sa patolohiya, ug kini nga mga pagbag-o mahimong dili makita sa transcriptome.
Human sa independente nga pag-analisar sa utok ug CSF proteome nga among nadiskobrehan, nagpahigayon kami og komprehensibo nga pag-analisar sa duha ka set sa datos aron mahibal-an ang mga biomarker sa AD CSF nga may kalabutan sa pathophysiology sa network sa utok. Kinahanglan una natong ipasabut ang overlap sa duha ka mga proteome. Bisan kung gidawat sa kadaghanan nga ang CSF nagpakita sa mga pagbag-o sa neurochemical sa utok sa AD (4), ang eksaktong lebel sa pagsapaw tali sa utok sa AD ug sa CSF proteome dili klaro. Pinaagi sa pagtandi sa gidaghanon sa gipaambit nga mga produkto sa gene nga nakit-an sa among duha ka proteome, among nakita nga hapit 70% (n = 1936) sa mga protina nga giila sa cerebrospinal fluid gi-quantified usab sa utok (Figure 4A). Kadaghanan niining nagsapaw-sapaw nga mga protina (n = 1721) gimapa sa usa sa 44 ka co-expression modules gikan sa discovery brain data set (Figure 4B). Sama sa gipaabot, ang unom ka kinadak-ang modulo sa utok (M1 ngadto sa M6) nagpakita sa kinadak-ang gidaghanon sa CSF nga nagsapaw. Bisan pa, adunay mas gagmay nga mga modulo sa utok (pananglitan, M15 ug M29) nga nakab-ot ang usa ka wala damha nga taas nga lebel sa pagsapaw, mas dako kaysa usa ka module sa utok nga doble ang gidak-on niini. Kini nagpalihok kanato sa pagsagop sa usa ka mas detalyado, gipalihok sa estadistika nga pamaagi aron makalkulo ang overlap tali sa utok ug cerebrospinal fluid.
(A ug B) Ang mga protina nga nakit-an sa utok sa pagkadiskobre ug mga set sa datos sa CSF nagsapaw. Kadaghanan niining nagsapaw-sapaw nga mga protina nalangkit sa usa sa 44 ka co-expression modules sa utok nga co-expression network. (C) Hibal-i ang overlap tali sa cerebrospinal fluid proteome ug sa utok network proteome. Ang matag laray sa mapa sa kainit nagrepresentar sa usa ka bulag nga pag-analisa sa overlap sa hypergeometric FET. Ang ibabaw nga laray naghulagway sa overlap (gray/black shading) tali sa brain module ug sa tibuok CSF proteome. Ang ikaduha nga linya naghulagway nga ang overlap tali sa mga modulo sa utok ug CSF nga protina (gi-shaded sa pula) labi nga gi-regulate sa AD (P <0.05). Ang ikatulo nga laray nagpakita nga ang overlap tali sa utok modules ug CSF protina (asul nga shading) mao ang kamahinungdanon down-regulated sa AD (P <0.05). Gamita ang pamaagi sa BH aron matul-id ang P value nga nakuha gikan sa FET. (D) Folding module panel base sa cell type association ug may kalabutan nga GO terms. Kini nga mga panel adunay kinatibuk-an nga 271 nga mga protina nga may kalabutan sa utok, nga adunay makahuluganon nga pagpahayag sa kalainan sa CSF proteome.
Gamit ang single-tailed FETs, among gi-assess ang importansya sa protein overlap tali sa CSF proteome ug indibidwal nga brain modules. Gipadayag sa pag-analisa nga ang kinatibuk-an nga 14 nga mga modulo sa utok sa set sa datos sa CSF adunay hinungdanon nga istatistika nga nagsapaw (FDR adjust P <0.05), ug usa ka dugang nga module (M18) kansang overlap hapit sa kamahinungdanon (FDR adjusted P = 0.06) (Figure 4C , ibabaw nga laray). Interesado usab kami sa mga module nga kusog nga nagsapaw sa lahi nga gipahayag nga mga protina sa CSF. Busa, nag-apply kami og duha ka dugang nga pag-analisa sa FET aron mahibal-an kung hain sa (i) CSF nga protina ang nadugangan pag-ayo sa AD ug (ii) Ang protina sa CSF mikunhod pag-ayo sa AD (P <0.05, gipares nga t test AD/kontrol) Ang mga modulo sa utok nga adunay makahuluganon nga pagsapaw. tali kanila. Ingon sa gipakita sa tunga-tunga ug ubos nga mga laray sa Figure 4C, kini nga mga dugang nga pag-analisar nagpakita nga ang 8 sa 44 nga mga modulo sa utok dako nga nagsapaw sa protina nga gidugang sa AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, ug M38) . ), samtang duha lamang ka modules (M6 ug M15) ang nagpakita sa usa ka makahuluganon nga pagsapaw sa pagkunhod sa protina sa AD CSF. Sama sa gipaabut, ang tanan nga 10 nga mga module naa sa 15 nga mga module nga adunay labing kataas nga overlap sa CSF proteome. Busa, atong gihunahuna nga kining 15 nga mga module kay taas nga ani nga tinubdan sa AD brain-derived CSF biomarkers.
Among gipilo kining 15 ka nagsapaw-sapaw nga mga module ngadto sa lima ka dagkong mga panel sa protina base sa ilang kaduol sa WGCNA tree diagram ug sa ilang pagpakig-uban sa mga tipo sa selula ug gene ontology (Figure 4D). Ang una nga panel adunay mga module nga dato sa mga marker sa neuron ug mga protina nga may kalabotan sa synapse (M1 ug M12). Ang synaptic panel naglangkob sa usa ka kinatibuk-an nga 94 nga mga protina, ug ang mga lebel sa CSF proteome nausab pag-ayo, nga naghimo niini nga pinakadako nga tinubdan sa mga marka sa CSF nga may kalabutan sa utok sa lima ka mga panel. Ang ikaduhang grupo (M6 ug M15) nagpakita sa suod nga koneksyon sa endothelial cell marker ug vascular body, sama sa "wound healing" (M6) ug "regulation of humoral immune response" (M15). Ang M15 adunay kalabotan usab sa metabolismo sa lipoprotein, nga suod nga kalambigitan sa endothelium (36). Ang vascular panel adunay 34 CSF marker nga may kalabutan sa utok. Ang ikatulo nga grupo naglakip sa mga modulo (M2 ug M4) nga adunay kalabutan sa oligodendrocyte marker ug pagdaghan sa selula. Pananglitan, ang top-level ontology nga mga termino sa M2 naglakip sa "positibong regulasyon sa DNA replication" ug "purine biosynthesis process". Samtang, ang sa M4 naglakip sa "glial cell differentiation" ug "chromosome segregation". Ang myelination panel adunay 49 CSF marker nga may kalabutan sa utok.
Ang ikaupat nga grupo naglangkob sa kadaghanan nga mga module (M30, M29, M18, M24, ug M5), ug halos tanan nga mga module adunay daghang mga microglia ug astrocyte marker. Susama sa myelination panel, ang ikaupat nga panel usab adunay mga module (M30, M29, ug M18) nga suod nga nalangkit sa pagdaghan sa selula. Ang ubang mga module sa kini nga grupo adunay kalabotan sa immunological nga mga termino, sama sa "immune effect process" (M5) ug "immune response regulation" (M24). Ang glial immune group adunay 42 ka CSF marker nga may kalabutan sa utok. Sa kataposan, ang kataposang panel naglakip sa 52 ka utok nga may kalabotan sa mga marka sa upat ka modules (M44, M3, M33, ug M38), nga ang tanan anaa sa lawas nga may kalabotan sa pagtipig sa enerhiya ug metabolismo. Ang pinakadako niini nga mga modules (M3) suod nga may kalabutan sa mitochondria ug dato sa neuron-specific marker. Ang M38 usa sa mas gamay nga mga miyembro sa module sa kini nga metabolome ug nagpakita usab sa kasarangan nga espesipiko sa neuron.
Sa kinatibuk-an, kini nga lima ka mga panel nagpakita sa usa ka halapad nga mga tipo sa cell ug mga gimbuhaton sa AD cortex, ug hiniusa nga adunay 271 nga mga marka nga may kalabotan sa utok nga CSF (Table S2G). Aron masusi ang kabalido niining mga resulta sa MS, gigamit namo ang proximity extension assay (PEA), usa ka orthogonal antibody-based nga teknolohiya nga adunay multiplexing nga mga kapabilidad, taas nga pagkasensitibo ug espesipiko, ug gisusi pag-usab ang mga sample sa cerebrospinal fluid nga among nakit-an Usa ka subset niining 271 biomarker. (n = 36). Kini nga mga target sa 36 nagpakita sa pagbag-o sa AD multiple sa PEA, nga suod nga may kalabutan sa among MS-based findings (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Nga kusganong nagpamatuod sa mga resulta sa among komprehensibo nga MS analysis (Figure S4 ).
Ang biolohikal nga mga tema nga gipasiugda sa among lima ka grupo, gikan sa synaptic signaling ngadto sa metabolismo sa enerhiya, ang tanan may kalabutan sa pathogenesis sa AD (1-3). Busa, ang tanan nga 15 nga mga module nga adunay kini nga mga panel adunay kalabotan sa patolohiya sa AD sa proteome sa utok nga among nadiskobrehan (Figure 2B). Ang labing kaila mao ang taas nga positibo nga pathological correlation tali sa among glial modules ug ang lig-on nga negatibo nga pathological correlation tali sa among pinakadako nga neuronal modules (M1 ug M3). Ang differential expression analysis sa among gi-replicated nga brain proteome (Figure S3D) nagpasiugda usab sa M5 ug M18-derived glial proteins. Sa AsymAD ug symptomatic AD, ang pinakadaghang glial proteins ug M1-related synapses. Kini nga mga obserbasyon nagpakita nga ang 271 cerebrospinal fluid marker nga among giila sa lima ka grupo adunay kalabutan sa mga proseso sa sakit sa AD cortex, lakip na ang mga mahitabo sa unang mga asymptomatic stages.
Aron mas maayo ang pag-analisar sa direksyon sa pagbag-o sa mga protina sa panel sa utok ug spinal fluid, among gidrowing ang mosunod alang sa matag usa sa 15 nga nagsapaw nga mga module: (i) nakit-an ang lebel sa kadagaya sa module sa set sa datos sa utok ug (ii) ang module protina Ang kalainan gipahayag sa cerebrospinal fluid (Figure S5). Sama sa gihisgutan sa sayo pa, ang WGCNA gigamit aron mahibal-an ang kadagaya sa module o kinaiya nga kantidad sa protina sa utok (13). Ang mapa sa bulkan gigamit sa paghulagway sa kalainan nga ekspresyon sa modular nga mga protina sa cerebrospinal fluid (AD/kontrol). Kini nga mga numero nagpakita nga tulo sa lima ka mga panel nagpakita sa lain-laing mga uso sa ekspresyon sa utok ug spinal fluid. Ang duha ka mga module sa synapse panel (M1 ug M12) nagpakita sa usa ka pagkunhod sa lebel sa kadagaya sa AD utok, apan kamahinungdanon nagsapaw sa dugang nga protina sa AD CSF (Figure S5A). Ang mga modulo nga may kalabotan sa neuron nga adunay sulud nga metabolome (M3 ug M38) nagpakita sa parehas nga mga pattern sa ekspresyon sa utok ug cerebrospinal fluid nga dili managsama (Figure S5E). Ang vascular panel nagpakita usab sa lain-laing mga uso sa ekspresyon, bisan pa ang mga modulo niini (M6 ug M15) kasarangan nga nadugangan sa utok sa AD ug mikunhod sa nasakit nga CSF (Figure S5B). Ang nahabilin nga duha ka mga panel adunay daghang mga glial network kansang mga protina kanunay nga gi-regulate sa duha nga mga kompartamento (Figure S5, C ug D).
Palihug timan-i nga kini nga mga uso dili kasagaran sa tanan nga mga marker niini nga mga panel. Pananglitan, ang synaptic panel naglakip sa daghang mga protina nga gikunhoran pag-ayo sa utok sa AD ug CSF (Figure S5A). Lakip niining mga down-regulated cerebrospinal fluid marker mao ang NPTX2 ug VGF sa M1, ug chromogranin B sa M12. Bisan pa, bisan pa niini nga mga eksepsiyon, kadaghanan sa among mga synaptic marker gipataas sa AD spinal fluid. Sa kinatibuk-an, kini nga mga pag-analisar nakahimo sa pag-ila sa mahinungdanon nga mga uso sa istatistika sa lebel sa utok ug cerebrospinal fluid sa matag usa sa among lima ka mga panel. Kini nga mga uso nagpasiugda sa komplikado ug kasagaran lainlain nga relasyon tali sa utok ug CSF nga protina nga ekspresyon sa AD.
Dayon, gigamit namo ang high-throughput nga MS replication analysis (CSF replication 1) aron hiktin ang among 271 set sa biomarkers ngadto sa pinaka-promising ug reproducible nga mga target (Figure 5A). Ang kopya sa CSF 1 adunay kinatibuk-an nga 96 nga mga sample gikan sa Emory Goizueta ADRC, lakip ang kontrol, AsymAD, ug AD cohort (Table S1A). Kini nga mga kaso sa AD gihulagway sa malumo nga pagkunhod sa panghunahuna (nagpasabot nga MoCA, 20.0 ± 3.8), ug mga pagbag-o sa AD biomarker nga gikumpirma sa cerebrospinal fluid (Table S1A). Sukwahi sa CSF analysis nga among nakit-an, kini nga replikasyon gihimo gamit ang usa ka mas episyente ug high-throughput nga "single-shot" nga pamaagi sa MS (nga walay off-line fractionation), lakip ang usa ka gipasimple nga sample preparation protocol nga nagwagtang sa panginahanglan alang sa immunodepletion sa indibidwal nga mga sample . Hinunoa, ang usa ka immune-depleted nga "enhancement channel" gigamit aron mapadako ang signal sa dili kaayo daghang protina (37). Bisan kung kini nagpakunhod sa kinatibuk-ang coverage sa proteome, kini nga single-shot nga pamaagi makapakunhod sa oras sa makina ug nagdugang sa gidaghanon sa mga sample nga may label nga TMT nga mahimong ma-analisa nga mabuhi (17, 38). Sa kinatibuk-an, giila sa pag-analisa ang 6,487 nga mga peptide, nga nag-mapa sa 1,183 nga mga proteome sa 96 nga mga kaso. Sama sa pag-analisa sa CSF nga among nakit-an, ang mga protina ra nga gi-quantified sa labing menos 50% sa mga sample ang gilakip sa sunud nga mga kalkulasyon, ug ang datos gi-regressed alang sa mga epekto sa edad ug gender. Misangpot kini sa kataposang pag-ihap sa 792 ka proteome, 95% niini giila usab sa CSF data set nga nakit-an.
(A) Ang mga target sa protina sa CSF nga may kalabotan sa utok nga napamatud-an sa una nga gikopya nga cohort sa CSF ug gilakip sa katapusan nga panel (n = 60). (B to E) Mga lebel sa biomarker sa panel (composite z-scores) nga gisukod sa upat ka CSF replication cohorts. Ang gipares nga t-tests o ANOVA nga adunay post-correction ni Tukey gigamit sa pagtimbang-timbang sa statistical significance sa mga kausaban sa kadagaya sa matag replicate analysis. CT, kontrol.
Tungod kay kami labi nga interesado sa pag-verify sa among 271 nga mga target sa CSF nga may kalabotan sa utok pinaagi sa komprehensibo nga pag-analisar, limitahan namon ang dugang nga pagsusi sa kini nga gisubli nga proteome sa kini nga mga marka. Taliwala niining 271 ka protina, 100 ang nakita sa CSF replication 1. Ang Figure S6A nagpakita sa differential expression niining 100 overlapping markers tali sa control ug AD replication samples. Ang mga synaptic ug metabolite nga histones mas motaas sa AD, samtang ang vascular proteins mas muburot sa sakit. Kadaghanan sa 100 nga nagsapaw-sapaw nga mga marka (n = 70) nagpabilin sa parehas nga direksyon sa pagbag-o sa duha ka set sa datos (Figure S6B). Kini nga 70 nga gi-validate nga mga marka sa CSF nga may kalabotan sa utok (Table S2H) kadaghanan nagpakita sa naobserbahan kaniadto nga mga uso sa ekspresyon sa panel, nga mao, ang down-regulation sa mga vascular protein ug ang up-regulation sa tanan nga uban pang mga panel. 10 lamang niining 70 ka validated nga mga protina ang nagpakita sa mga kausaban sa AD kadagaya nga sukwahi niini nga mga uso sa panel. Aron makamugna og usa ka panel nga labing maayo nga nagpakita sa kinatibuk-ang uso sa utok ug cerebrospinal fluid, wala namo iapil kining 10 ka protina gikan sa panel sa interes nga sa katapusan among gipamatud-an (Figure 5A). Busa, ang among panel sa katapusan naglakip sa kinatibuk-an nga 60 ka protina nga na-verify sa duha ka independenteng CSF AD cohorts gamit ang lain-laing sample nga pagpangandam ug MS platform analysis. Ang z-score nga ekspresyon nga mga laraw niining mga katapusang panel sa CSF copy 1 control ug AD nga mga kaso nagpamatuod sa panel trend nga nakita sa CSF cohort nga among nakit-an (Figure 5B).
Taliwala niining 60 ka protina, adunay mga molekula nga nailhan nga nalangkit sa AD, sama sa osteopontin (SPP1), nga usa ka pro-inflammatory cytokine nga nalambigit sa AD sa daghang mga pagtuon (39-41), ug GAP43, Usa ka synaptic protein. nga klaro nga nalambigit sa neurodegeneration (42). Ang labing hingpit nga napamatud-an nga mga protina mao ang mga marker nga may kalabotan sa uban pang mga sakit nga neurodegenerative, sama sa amyotrophic lateral sclerosis (ALS) nga may kalabutan nga superoxide dismutase 1 (SOD1) ug sakit nga may kalabotan sa Parkinson nga desaccharase (PARK7). Gipamatud-an usab namo nga daghang uban pang mga marker, sama sa SMOC1 ug utok-rich membrane attachment signaling protein 1 (BASP1), adunay limitado nga nangaging mga link sa neurodegeneration. Angay nga matikdan nga tungod sa ilang ubos nga kinatibuk-ang kadagaya sa CSF proteome, lisud alang kanato nga gamiton kining high-throughput nga single-shot detection nga pamaagi aron masaligan nga makamatikod sa MAPT ug uban pang mga AD-related nga mga protina (pananglitan, NEFL ug NRGN ) ( 43, 44 ).
Dayon among gisusi kining 60 ka priority panel marker sa tulo ka dugang nga replicate analysis. Sa CSF Copy 2, gigamit namon ang usa ka TMT-MS aron pag-analisar sa usa ka independente nga grupo sa kontrol sa 297 ug mga sample sa AD gikan sa Emory Goizueta ADRC (17). Ang CSF replication 3 naglakip sa reanalysis sa anaa nga TMT-MS data gikan sa 120 control ug AD nga mga pasyente gikan sa Lausanne, Switzerland (45). Nakit-an namo ang labaw sa dos-tersiya sa 60 ka priority marker sa matag dataset. Bisan tuod ang Swiss nga pagtuon migamit ug lain-laing mga MS platform ug TMT quantification nga mga pamaagi (45, 46), kusganon namong giprodyus ang among mga uso sa panel sa duha ka balik-balik nga pag-analisar (Figure 5, C ug D, ug Tables S2, I, ug J). Sa pagtimbang-timbang sa espesipiko sa sakit sa among grupo, gigamit namo ang TMT-MS sa pag-analisar sa ika-upat nga replication data set (CSF replication 4), nga naglakip dili lamang sa pagkontrol (n = 18) ug AD (n = 17) nga mga kaso, apan usab sa PD ( n = 14)), ALS (n = 18) ug frontotemporal dementia (FTD) nga mga sample (n = 11) (Table S1A). Malampuson namon nga gibanabana ang hapit dos-tersiya sa mga protina sa panel sa kini nga cohort (38 sa 60). Kini nga mga resulta nagpasiugda sa AD-spesipikong mga kausaban sa tanang lima ka biomarker panels (Figure 5E ug Table S2K). Ang pagtaas sa metabolite nga grupo nagpakita sa pinakalig-on nga AD specificity, gisundan sa myelination ug glial nga grupo. Sa gamay nga gidak-on, ang FTD nagpakita usab sa usa ka pagtaas sa taliwala niini nga mga panel, nga mahimong magpakita sa parehas nga potensyal nga pagbag-o sa network (17). Sa kasukwahi, ang ALS ug PD nagpakita sa halos parehas nga myelination, glial, ug metabolome nga mga profile sama sa control group. Sa kinatibuk-an, bisan pa sa mga kalainan sa pag-andam sa sample, MS platform, ug TMT quantification nga mga pamaagi, kini nga gibalikbalik nga pag-analisar nagpakita nga ang among priority panel marker adunay makanunayon nga AD-specific nga mga kausaban sa labaw pa sa 500 ka talagsaon nga mga sample sa CSF.
Ang AD neurodegeneration kay kaylap nga giila pipila ka tuig sa wala pa ang pagsugod sa mga sintomas sa panghunahuna, mao nga adunay dinalian nga panginahanglan alang sa mga biomarker sa AsymAD (5, 31). Bisan pa, nagkadaghan ang mga ebidensya nga nagpakita nga ang biology sa AsymAD layo sa homogenous, ug ang komplikado nga interaksyon sa peligro ug kalig-on nagdala sa daghang mga kalainan sa indibidwal sa sunod nga pag-uswag sa sakit (47). Bisan kung gigamit aron mahibal-an ang mga kaso sa AsymAD, ang lebel sa mga core CSF biomarker (Aβ1-42, total tau ug p-tau) wala napamatud-an nga kasaligan nga makatagna kung kinsa ang mouswag sa dementia (4, 7), nga nagpakita nga labi pa. gikinahanglan nga maglakip sa holistic biomarker nga mga himan base sa daghang mga aspeto sa utok physiology sa tukma nga stratify sa risgo niini nga populasyon. Busa, among gisusi ang among AD-validated biomarker panel sa AsymAD nga populasyon sa CSF copy 1. Kining 31 AsymAD nga mga kaso nagpakita sa abnormal nga core biomarker nga lebel (Aβ1-42 / total tau ELISA ratio, <5.5) ug kompleto nga pag-ila (mean MoCA, 27.1 ± 2.2) (Table S1A). Dugang pa, ang tanan nga mga indibidwal nga adunay AsymAD adunay usa ka klinikal nga dementia nga marka nga 0, nga nagpakita nga wala’y ebidensya sa usa ka pagkunhod sa adlaw-adlaw nga pag-ila o pag-andar nga pasundayag.
Una namon nga gi-analisar ang lebel sa mga balido nga mga panel sa tanan nga 96 CSF nga nag-replika sa 1, lakip ang AsymAD cohort. Among nakaplagan nga daghang mga panel sa AsymAD nga grupo adunay mahinungdanon nga AD-sama sa kadagaya nga mga kausaban, ang vascular panel nagpakita sa usa ka ubos nga uso sa AsymAD, samtang ang tanan nga uban nga mga panel nagpakita sa usa ka pataas nga uso (Figure 6A). Busa, ang tanan nga mga panel nagpakita sa usa ka mahinungdanon kaayo nga correlation sa ELISA Aβ1-42 ug total nga lebel sa tau (Figure 6B). Sa kasukwahi, ang correlation tali sa grupo ug sa MoCA score medyo dili maayo. Usa sa labi ka makapakurat nga mga nahibal-an gikan sa kini nga mga pag-analisar mao ang daghang sakup sa mga abundance sa panel sa AsymAD cohort. Sama sa gipakita sa Figure 6A, ang lebel sa panel sa grupo sa AsymAD kasagarang motabok sa lebel sa panel sa control group ug sa AD nga grupo, nga nagpakita sa medyo taas nga kabag-ohan. Aron masusi pa kini nga heterogeneity sa AsymAD, among gipadapat ang Multidimensional Scaling (MDS) analysis sa 96 CSF replication 1 nga mga kaso. Gitugotan sa pag-analisa sa MDS nga mahanduraw ang pagkaparehas sa mga kaso base sa pipila nga mga variable sa set sa datos. Alang sa kini nga pag-analisa sa cluster, gigamit ra namon ang mga gi-validate nga mga marker sa panel nga adunay hinungdanon nga pagbag-o sa istatistika (P <0.05, AD / kontrol) sa pagkadiskobre sa CSF ug pagkopya sa 1 proteome (n = 29) (Table S2L) nga lebel. Kini nga pag-analisa nagpatunghag tin-aw nga spatial clustering tali sa among kontrol ug mga kaso sa AD (Figure 6C). Sa kasukwahi, ang pipila ka mga kaso sa AsymAD tin-aw nga gipundok sa kontrol nga grupo, samtang ang uban nahimutang sa mga kaso sa AD. Aron masusi pa kini nga AsymAD heterogeneity, gigamit namo ang among MDS nga mapa sa paghubit sa duha ka grupo niining mga kaso sa AsymAD. Ang una nga grupo naglakip sa mga kaso sa AsymAD nga mas duol sa kontrol (n = 19), samtang ang ikaduha nga grupo gihulagway sa mga kaso sa AsymAD nga adunay profile sa marker nga mas duol sa AD (n = 12).
(A) Ang lebel sa ekspresyon (z-score) sa CSF biomarker nga grupo sa tanan nga 96 nga mga sample sa CSF replication 1 cohort, lakip ang AsymAD. Ang pag-analisar sa kalainan sa post-correction ni Tukey gigamit sa pagtimbang-timbang sa istatistikal nga kahulogan sa mga kausaban sa kadagaya sa panel. (B) Correlation analysis sa panel protein abundance level (z-score) uban sa MoCA score ug total tau level sa ELISA Aβ1-42 ug CSF copy 1 samples. Ang Pearson correlation coefficient uban sa may kalabutan nga P value gipakita. (C) Ang MDS sa 96 CSF copy 1 nga mga kaso gibase sa kadagaya nga lebel sa 29 validated panel markers, nga nausab pag-ayo sa pagkadiskobre ug CSF copy 1 data sets [P <0.05 AD/control (CT)]. Kini nga pagtuki gigamit sa pagbahin sa AsymAD nga grupo ngadto sa kontrol (n = 19) ug AD (n = 12) nga mga subgroup. (D) Ang laraw sa bulkan nagpakita sa kalainan nga ekspresyon sa tanang CSF replication 1 nga mga protina nga adunay log2 fold change (x-axis) kalabot sa -log10 statistical P value tali sa duha ka AsymAD subgroups. Ang mga biomarker sa panel adunay kolor. (E) Ang replikasyon sa CSF 1 nga lebel sa kadagaya sa mga biomarker sa pagpili nga grupo lahi nga gipahayag tali sa mga subgroup sa AsymAD. Ang post-adjusted analysis ni Tukey sa variance gigamit aron masusi ang statistical significance.
Among gisusi ang differential protein expression tali niini nga kontrol ug AD-like AsymAD nga mga kaso (Figure 6D ug Table S2L). Ang resulta nga mapa sa bulkan nagpakita nga 14 ka panel marker ang nausab pag-ayo tali sa duha ka grupo. Kadaghanan niini nga mga marker kay sakop sa synapse ug metabolome. Bisan pa, ang SOD1 ug myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate (MARCKS), nga mga miyembro sa myelin ug glial immune nga mga grupo, matag usa, nahisakop usab sa kini nga grupo (Figure 6, D ug E). Ang vascular panel nag-amot usab og duha ka mga marker nga gikunhoran pag-ayo sa AD-like AsymAD nga grupo, lakip ang AE binding protein 1 (AEBP1) ug nagsuporta sa miyembro sa pamilya nga C9. Walay mahinungdanong kalainan tali sa kontrol ug AD-sama sa AsymAD nga mga subgroup sa ELISA AB1-42 (P = 0.38) ug p-tau (P = 0.28), apan adunay usa ka mahinungdanong kalainan sa kinatibuk-ang lebel sa tau (P = 0.0031). ) (Fig. S7). Adunay daghang mga marka sa panel nga nagpakita nga ang mga pagbag-o tali sa duha nga mga subgroup sa AsymAD labi ka hinungdanon kaysa sa kinatibuk-ang lebel sa tau (pananglitan, YWHAZ, SOD1, ug MDH1) (Figure 6E). Sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpakita nga ang among validated panel mahimong adunay mga biomarker nga mahimong subtype ug potensyal nga risgo nga stratification sa mga pasyente nga adunay asymptomatic disease.
Adunay dinalian nga panginahanglan alang sa mga himan nga biomarker nga nakabase sa sistema aron mas maayo nga masukod ug target ang lainlaing pathophysiology luyo sa AD. Kini nga mga himan gilauman nga dili lamang magbag-o sa among AD diagnostic framework, apan nagpasiugda usab sa pagsagop sa epektibo, espesipikong mga estratehiya sa pagtambal sa pasyente (1, 2). Sa kini nga katuyoan, nag-aplay kami usa ka dili mapihigon nga komprehensibo nga pamaagi sa proteomics sa utok sa AD ug CSF aron mahibal-an ang mga biomarker sa CSF nga nakabase sa web nga nagpakita sa usa ka halapad nga pathophysiology nga nakabase sa utok. Ang among pag-analisa nagpatunghag lima ka CSF biomarker panels, nga (i) nagpakita sa synapses, blood vessels, myelin, immune ug metabolic dysfunction; (ii) nagpakita sa lig-on nga reproducibility sa lain-laing mga MS platform; (iii) Ipakita ang mga progresibong kausaban nga espesipiko sa sakit sa tibuok sayo ug ulahing yugto sa AD. Sa kinatibuk-an, kini nga mga nahibal-an nagrepresentar sa usa ka maayong lakang padulong sa pag-uswag sa lainlain, kasaligan, web-oriented nga biomarker nga mga himan alang sa panukiduki sa AD ug klinikal nga aplikasyon.
Gipakita sa among mga resulta ang labi ka gikonserba nga organisasyon sa AD brain network proteome ug gisuportahan ang paggamit niini ingon usa ka angkla alang sa pagpauswag sa biomarker nga nakabase sa sistema. Gipakita sa among pag-analisar nga ang duha nga independente nga mga dataset sa TMT-MS nga adunay sulud nga utok sa AD ug AsymAD adunay lig-on nga modularity. Kini nga mga nahibal-an nagpalapad sa among miaging trabaho, nga nagpakita sa pagpreserbar sa gamhanan nga mga modulo sa labaw pa sa 2,000 nga mga tisyu sa utok gikan sa daghang mga independent cohorts sa frontal, parietal, ug temporal cortex (17). Kini nga network sa consensus nagpakita sa lainlaing mga pagbag-o nga may kalabotan sa sakit nga naobserbahan sa karon nga panukiduki, lakip ang pagdugang sa mga modulo nga makapahubag nga puno sa glial ug ang pagkunhod sa mga module nga puno sa neuron. Sama sa karon nga panukiduki, kini nga dako nga network adunay usab hinungdanon nga mga pagbag-o sa modular sa AsymAD, nga nagpakita sa lainlaing lainlaing preclinical pathophysiology (17).
Bisan pa, sa sulod niining labi ka konserbatibo nga balangkas nga nakabase sa sistema, adunay labi ka pino nga biological heterogeneity, labi na sa mga indibidwal sa sayong mga yugto sa AD. Ang among biomarker panel makahimo sa paghulagway sa duha ka mga subgroup sa AsymAD, nga nagpakita sa mahinungdanong kalainan nga ekspresyon sa daghang mga marka sa CSF. Ang among grupo nakahimo sa pagpasiugda sa biolohikal nga mga kalainan tali niining duha ka subgroup, nga dili klaro sa lebel sa core AD biomarkers. Kung itandi sa control group, ang Aβ1-42/total tau ratios niining AsymAD nga mga indibidwal kay abnormally low. Bisan pa, ang kinatibuk-ang lebel sa tau ra ang lahi kaayo sa taliwala sa duha nga mga subgroup sa AsymAD, samtang ang lebel sa Aβ1-42 ug p-tau nagpabilin nga medyo managsama. Tungod kay ang taas nga CSF tau daw usa ka mas maayo nga tigtagna sa mga sintomas sa panghunahuna kaysa Aβ1-42 nga lebel (7), kami nagduda nga ang duha ka AsymAD cohorts mahimong adunay lain-laing mga risgo sa pag-uswag sa sakit. Tungod sa limitado nga sample nga gidak-on sa among AsymAD ug ang kakulang sa longhitudinal data, gikinahanglan ang dugang nga panukiduki aron masaligon nga makuha kini nga mga konklusyon. Bisan pa, kini nga mga resulta nagpakita nga ang usa ka sistema nga nakabase sa CSF panel makapauswag sa atong abilidad sa epektibong pag-stratify sa mga indibidwal sa panahon sa asymptomatic nga yugto sa sakit.
Sa kinatibuk-an, ang among mga nahibal-an nagsuporta sa papel sa daghang mga biological function sa pathogenesis sa AD. Bisan pa, ang dysregulated nga metabolismo sa enerhiya nahimong prominenteng tema sa tanan namong lima ka validated labeling panels. Ang mga metabolikong protina, sama sa hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) ug lactate dehydrogenase A (LDHA), mao ang labing lig-on nga gi-validate nga synaptic biomarker, nga nagpaila nga ang pagtaas sa AD CSF kay daghan kaayong reproducible nga sekso. Ang among mga kaugatan sa dugo ug mga glial panel adunay usab daghang mga marker nga nahilambigit sa metabolismo sa mga oxidative substance. Kini nga mga nahibal-an nahiuyon sa hinungdanon nga papel nga gidula sa mga proseso sa metaboliko sa tibuuk nga utok, dili lamang aron matubag ang taas nga panginahanglanon sa enerhiya sa mga neuron, apan aron matubag usab ang taas nga panginahanglanon sa enerhiya sa mga astrocytes ug uban pang mga glial cells (17, 48). Ang among mga resulta nagsuporta sa nagkadako nga ebidensya nga ang mga pagbag-o sa redox nga potensyal ug pagkabalda sa mga agianan sa enerhiya mahimo nga ang kinauyokan nga sumpay tali sa pipila ka mga importanteng proseso nga nalangkit sa pathogenesis sa AD, lakip na ang mitochondrial disorder, glial-mediated inflammation, ug Vascular damage (49). Dugang pa, ang metabolic cerebrospinal fluid biomarker naglangkob sa daghang gidaghanon sa mga nagkalain-laing mga protina sa taliwala sa atong kontrol ug AD-sama sa AsymAD subgroups, nga nagsugyot nga ang pagkabalda niini nga enerhiya ug redox nga mga agianan mahimong kritikal sa preclinical nga yugto sa sakit.
Ang lain-laing utok ug cerebrospinal fluid panel uso nga atong naobserbahan adunay usab makapaikag nga biological implikasyon. Ang mga synapses ug metabolomes nga dato sa mga neuron nagpakita sa pagkunhod sa lebel sa AD utok ug dugang nga kadagaya sa cerebrospinal fluid. Gihatag nga ang mga neuron dato sa mitochondria nga nagpatunghag enerhiya sa mga synapses aron maghatag kusog alang sa ilang daghang mga espesyal nga signal (50), gilauman ang pagkaparehas sa mga profile sa ekspresyon niining duha nga mga grupo sa neuron. Ang pagkawala sa mga neuron ug ang extrusion sa nadaot nga mga selula makapatin-aw niini nga utok ug CSF panel uso sa ulahi nga sakit, apan sila dili makapatin-aw sa unang mga kausaban sa panel nga atong nakita (13). Usa ka posible nga katin-awan alang niini nga mga nahibal-an sa sayo nga asymptomatic nga sakit mao ang abnormal nga synaptic pruning. Ang bag-ong ebidensya sa mga modelo sa mouse nagsugyot nga ang microglia-mediated synaptic phagocytosis mahimong abnormal nga ma-activate sa AD ug mosangpot sa sayo nga pagkawala sa synapse sa utok (51). Kining gilabay nga synaptic nga materyal mahimong matipon sa CSF, mao nga atong naobserbahan ang pagtaas sa CSF sa neuron panel. Ang immune-mediated synaptic pruning mahimo usab nga partially explain ang pagtaas sa glial proteins nga atong nakita sa utok ug cerebrospinal fluid sa tibuok proseso sa sakit. Dugang sa synaptic pruning, ang kinatibuk-ang abnormalidad sa exocytic pathway mahimo usab nga mosangpot sa lain-laing utok ug CSF nga mga ekspresyon sa neuronal marker. Gipakita sa daghang mga pagtuon nga ang sulud sa mga exosome sa pathogenesis sa utok sa AD nausab (52). Ang extracellular pathway nalangkit usab sa pagdaghan sa Aβ (53, 54). Angay nga matikdan nga ang pagsumpo sa exosomal secretion mahimong makunhuran ang AD-sama sa patolohiya sa AD transgenic mouse nga mga modelo (55).
Sa samang higayon, ang protina sa vascular panel nagpakita sa usa ka kasarangan nga pagtaas sa AD utok, apan sa kamahinungdanon pagkunhod sa CSF. Ang babag sa dugo-utok (BBB) disfunction mahimong bahin nga ipasabut kini nga mga nahibal-an. Daghang mga independente nga postmortem human nga mga pagtuon ang nagpakita sa pagkahugno sa BBB sa AD (56, 57). Kini nga mga pagtuon nagpamatuod sa nagkalain-laing abnormal nga mga kalihokan nga naglibot niining hugot nga silyado nga layer sa endothelial cells, lakip na ang brain capillary leakage ug perivascular accumulation sa blood-borne proteins (57). Makahatag kini usa ka yano nga katin-awan alang sa taas nga mga protina sa vascular sa utok, apan dili kini hingpit nga makapatin-aw sa pagkahurot sa parehas nga mga protina sa cerebrospinal fluid. Ang usa ka posibilidad mao nga ang sentral nga sistema sa nerbiyos aktibo nga nagbulag sa kini nga mga molekula aron masulbad ang problema sa dugang nga panghubag ug stress sa oxidative. Ang pagkunhod sa pipila sa labing grabe nga mga protina sa CSF sa kini nga panel, labi na kadtong nalambigit sa regulasyon sa lipoprotein, adunay kalabotan sa pagdili sa makadaot nga lebel sa panghubag ug ang proseso sa neuroprotective sa mga reaktibo nga species sa oxygen. Tinuod kini alang sa Paroxonase 1 (PON1), usa ka enzyme nga nagbugkos sa lipoprotein nga responsable sa pagkunhod sa lebel sa stress sa oxidative sa sirkulasyon (58, 59). Ang Alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) usa pa ka mahinungdanong down-regulated marker sa vascular group. Kini ang pasiuna sa bikunin nga transporter sa lipid, nga nalangkit usab sa pagsumpo sa panghubag ug Proteksyon sa neurological (60, 61).
Bisan pa sa lainlaing makapaikag nga mga pangagpas, ang kawalay katakus nga direkta nga makit-an ang mga mekanismo sa biochemical nga sakit usa ka nahibal-an nga limitasyon sa pagtuki nga gimaneho sa pagdiskobre sa proteomics. Busa, ang dugang nga panukiduki gikinahanglan aron masaligon nga mahibal-an ang mga mekanismo sa luyo niining mga biomarker panel. Aron makalihok padulong sa pagpalambo sa MS-based clinical analysis, ang umaabot nga direksyon nagkinahanglan usab sa paggamit sa gipunting nga quantitative nga mga pamaagi alang sa dako nga pag-verify sa biomarker, sama sa selective o parallel reaction monitoring (62). Bag-ohay lang nga gigamit namon ang parallel reaction monitoring (63) aron ma-validate ang daghang mga pagbag-o sa protina sa CSF nga gihulagway dinhi. Daghang mga target sa priority panel ang gi-quantified nga adunay hinungdanon nga katukma, lakip ang YWHAZ, ALDOA, ug SMOC1, nga mapa sa among synapse, metabolismo, ug mga panel sa panghubag, matag usa (63). Ang Independent Data Acquisition (DIA) ug uban pang mga estratehiya nga nakabase sa MS mahimo usab nga mapuslanon alang sa pag-verify sa target. Bud ug uban pa. (64) Kini bag-o lang nagpakita nga adunay usa ka mahinungdanon nga pagsapaw tali sa AD biomarkers nga giila sa among CSF discovery data set ug ang independente nga DIA-MS data set, nga naglangkob sa dul-an sa 200 CSF samples gikan sa tulo ka lain-laing mga European cohorts. Kining bag-o nga mga pagtuon nagsuporta sa potensyal sa atong mga panel nga mausab ngadto sa kasaligan nga MS-based detection. Ang tradisyonal nga antibody ug aptamer-based detection importante usab alang sa dugang nga pagpalambo sa mga yawe nga AD biomarker. Tungod sa ubos nga kadagaya sa CSF, mas lisud ang pag-ila niini nga mga biomarker gamit ang high-throughput nga mga pamaagi sa MS. Ang NEFL ug NRGN duha ka pananglitan sa ubos nga abunda nga CSF biomarker, nga gi-mapa sa panel sa among komprehensibo nga pag-analisar, apan dili masaligan nga makit-an gamit ang among usa ka estratehiya sa MS. Ang mga estratehiya sa pagtarget base sa daghang mga antibodies, sama sa PEA, mahimong magpasiugda sa klinikal nga pagbag-o sa kini nga mga marka.
Sa kinatibuk-an, kini nga pagtuon naghatag usa ka talagsaon nga pamaagi sa proteomics alang sa pag-ila ug pag-verify sa mga biomarker sa CSF AD base sa lainlaing mga sistema. Ang pag-optimize sa kini nga mga marker panel sa mga dugang nga AD cohorts ug MS platform mahimong mapamatud-an nga nagsaad nga isulong ang stratification ug pagtambal sa peligro sa AD. Ang mga pagtuon nga nag-evaluate sa longhitudinal nga lebel sa kini nga mga panel sa paglabay sa panahon kritikal usab aron mahibal-an kung unsang kombinasyon sa mga marker ang labing maayo nga stratifies sa risgo sa sayo nga sakit ug mga pagbag-o sa kagrabe sa sakit.
Gawas sa 3 nga mga sample nga gikopya sa CSF, ang tanan nga mga sampol sa CSF nga gigamit niini nga pagtuon gikolekta ubos sa pagdumala sa Emory ADRC o suod nga may kalabutan nga mga institusyon sa panukiduki. Usa ka kinatibuk-an nga upat ka set sa mga sample sa Emory CSF ang gigamit sa kini nga mga pagtuon sa proteomics. Ang CSF cohort nakit-an nga adunay mga sample gikan sa 20 ka himsog nga kontrol ug 20 nga mga pasyente sa AD. Ang CSF copy 1 naglakip sa mga sample gikan sa 32 ka himsog nga kontrol, 31 ka AsymAD nga mga indibidwal, ug 33 ka AD nga mga indibidwal. Ang kopya sa CSF 2 adunay 147 nga mga kontrol ug 150 AD nga mga sample. Ang multi-disease CSF replication 4 cohort naglakip sa 18 controls, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, ug 11 FTD samples. Sumala sa kasabutan nga gi-aprobahan sa Emory University Institutional Review Board, ang tanan nga mga partisipante sa pagtuon sa Emory nakakuha og pahibalo nga pagtugot. Sumala sa 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines para sa Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), ang cerebrospinal fluid nakolekta ug gitipigan pinaagi sa lumbar puncture. Ang Control ug AsymAD ug AD nga mga pasyente nakadawat og standardized cognitive assessment sa Emory Cognitive Neurology Clinic o Goizueta ADRC. Ang ilang mga sample sa cerebrospinal fluid gisulayan sa INNO-BIA AlzBio3 Luminex alang sa ELISA Aβ1-42, total tau ug p-tau analysis (65). Ang mga kantidad sa ELISA gigamit aron suportahan ang klasipikasyon sa diagnostic sa mga hilisgutan base sa natukod nga AD biomarker cut-off criteria (66, 67). Ang batakang demograpiko ug diagnostic nga datos alang sa ubang CSF diagnoses (FTD, ALS, ug PD) nakuha usab gikan sa Emory ADRC o mga kaubang research nga institusyon. Ang summary case metadata alang niining mga kaso sa Emory CSF makita sa Table S1A. Ang mga kinaiya sa Swiss CSF replication 3 cohort na-publish na kaniadto (45).
Nakit-an sa CSF ang sample. Aron madugangan ang giladmon sa among pagkadiskobre sa set sa datos sa CSF, ang pagkonsumo sa immune sa taas nga abunda nga mga protina gihimo sa wala pa ang trypsinization. Sa laktud, 130 μl sa CSF gikan sa 40 ka indibidwal nga mga sample sa CSF ug usa ka patas nga gidaghanon (130 μl) sa High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) gibutang sa usa ka spin column (Thermo Fisher Scientific, A89868) sa kwarto temperatura Incubate). Human sa pagtuyok sulod sa 15 minutos, centrifuge ang sample sa 1000g sulod sa 2 minutos. Usa ka 3K ultracentrifugal filter device (Millipore, UFC500396) gigamit sa pagkonsentrar sa effluent sample pinaagi sa centrifuging sa 14,000g sulod sa 30 minutos. Dilute ang tanang sample volume ngadto sa 75 μl sa phosphate buffered saline. Ang konsentrasyon sa protina gisusi pinaagi sa bicinchoninic acid (BCA) nga pamaagi sumala sa protocol sa tiggama (Thermo Fisher Scientific). Ang immunodepleted CSF (60 μl) gikan sa tanan nga 40 nga mga sample gitunaw sa lysyl endopeptidase (LysC) ug trypsin. Sa laktud, ang sample gipakunhod ug gi-alkylated sa 1.2 μl 0.5 M tris-2 (-carboxyethyl) -phosphine ug 3 μl 0.8 M chloroacetamide sa 90 ° C sulod sa 10 minutos, ug dayon sonicated sa usa ka water bath sulod sa 15 minutos. Ang sample lasaw sa 193 μl 8 M urea buffer [8 M urea ug 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] ngadto sa katapusang konsentrasyon sa 6 M urea. Ang LysC (4.5 μg; Wako) gigamit alang sa tibuok gabii nga paghilis sa temperatura sa lawak. Ang sample dayon lasaw sa 1 M urea nga adunay 50 mM ammonium bicarbonate (ABC) (68). Idugang ang parehas nga kantidad (4.5 μg) sa trypsin (Promega), ug dayon i-incubate ang sample sulod sa 12 ka oras. Acidify ang digested peptide solution ngadto sa katapusang konsentrasyon sa 1% formic acid (FA) ug 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) (66), ug dayon desalt gamit ang 50 mg Sep-Pak C18 column (Waters) sama sa gihulagway sa ibabaw (25) . Ang peptide dayon gi-eluted sa 1 ml nga 50% acetonitrile (ACN). Aron ma-standardize ang quantification sa protina sa tibuok batch (25), ang 100 μl aliquots gikan sa tanang 40 CSF samples gihiusa aron makamugna og mixed sample, nga gibahin dayon ngadto sa lima ka global internal standard (GIS) (48) samples. Ang tanan nga indibidwal nga mga sample ug hiniusa nga mga sumbanan gipauga sa high-speed vacuum (Labconco).
Gikopya sa CSF ang sample. Gihulagway kaniadto ni Dayon ug mga kaubanan ang immune depletion ug digestion sa CSF copy 3 samples (45, 46). Ang nahabilin nga mga kopya nga mga sample dili indibidwal nga immunodepleted. Hilumon kining wala matangtang nga mga sample sa trypsin sama sa gihulagway kaniadto (17). Alang sa matag gibalikbalik nga pag-analisar, ang 120 μl nga mga aliquot sa eluted peptide gikan sa matag sample gihiusa ug gibahin ngadto sa managsama nga gidaghanon nga mga aliquots nga gamiton isip TMT-label nga global internal standard (48). Ang tanan nga indibidwal nga mga sample ug hiniusa nga mga sumbanan gipauga sa high-speed vacuum (Labconco). Aron mapalambo ang signal sa ubos nga abunda nga CSF nga protina, pinaagi sa paghiusa sa 125 μl gikan sa matag sample, usa ka "gipalambo" nga sample ang giandam alang sa matag replicate analysis [ie, usa ka biological nga sample nga nagsundog sa sample sa panukiduki, apan ang kantidad nga anaa mao ang mas dako (37, 69)] gihiusa ngadto sa usa ka mixed CSF sample (17). Ang sinagol nga sample dayon immunoremoved gamit ang 12 ml sa High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digested sama sa gihulagway sa ibabaw, ug gilakip sa sunod nga daghang TMT labeling.
Oras sa pag-post: Aug-27-2021