Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon sa browser nga imong gigamit adunay limitado nga suporta sa CSS. Alang sa labing kaayo nga kasinatian, among girekomenda nga mogamit ka usa ka bag-ong browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Sa kasamtangan, aron masiguro ang padayon nga suporta, among ihatag ang site nga walay mga estilo ug JavaScript.
Ang mga Thermophile mao ang mga mikroorganismo nga molambo sa taas nga temperatura. Ang pagtuon niini makahatag ug bililhong impormasyon bahin sa kon sa unsang paagi ang kinabuhi mopahiangay sa grabeng mga kahimtang. Bisan pa, lisud ang pagkab-ot sa taas nga mga kondisyon sa temperatura gamit ang naandan nga optical microscope. Daghang mga solusyon nga gihimo sa balay base sa lokal nga resistive nga pagpainit sa kuryente ang gisugyot, apan wala’y yano nga solusyon sa komersyo. Niini nga papel, gipaila namo ang konsepto sa microscale laser heating sa ibabaw sa microscope field of view aron makahatag og taas nga temperatura alang sa thermophile nga mga pagtuon samtang nagpabilin nga malumo ang palibot sa user. Ang microscale nga pagpainit sa kasarangan nga intensity sa laser mahimong makab-ot gamit ang usa ka bulawan nga nanoparticle nga adunay sapaw nga substrate ingon usa ka biocompatible ug episyente nga light absorber. Gihisgutan ang posibleng mga epekto sa microscale fluid convection, cell retention, ug centrifugal thermophoretic motion. Ang pamaagi gipakita sa duha ka espisye: (i) Geobacillus stearothermophilus, usa ka aktibo nga thermophilic bacterium nga mosanay sa mga 65°C, nga atong naobserbahan nga moturok, motubo ug molangoy ubos sa microscale heating; (ii) Thiobacillus sp., usa ka labing maayo nga hyperthermophilic archaea. sa 80°C. Kini nga trabaho naghatag dalan alang sa yano ug luwas nga pag-obserbar sa mga thermophilic microorganism gamit ang moderno ug barato nga mga gamit sa mikroskopya.
Sulod sa binilyon ka tuig, ang kinabuhi sa Yuta milambo aron ipahiangay sa usa ka halapad nga kahimtang sa kalikopan nga usahay giisip nga grabe sa atong panan-aw sa tawo. Sa partikular, ang pipila ka mga thermophilic microorganisms (bakterya, archaea, fungi) nga gitawag ug thermophiles molambo sa temperatura range gikan sa 45°C ngadto sa 122°C1, 2, 3, 4. Thermophile nagpuyo sa lain-laing mga ekosistema, sama sa lawom nga dagat hydrothermal vents, init nga mga tubod. o mga lugar nga bulkan. Ang ilang panukiduki nakamugna ug daghang interes sa miaging pipila ka dekada sa labing menos duha ka rason. Una, makakat-on kita gikan kanila, pananglitan, kon sa unsang paagi ang mga thermophile 5, 6, mga enzyme 7, 8 ug mga membrana 9 lig-on sa ingon ka taas nga temperatura, o kon sa unsang paagi ang mga thermophile makasugakod sa grabeng lebel sa radiation10. Ikaduha, sila ang basehan sa daghang importanteng biotechnological applications1,11,12 sama sa fuel production13,14,15,16, chemical synthesis (dihydro, alcohols, methane, amino acids, etc.)17, biomining18 ug thermostable biocatalysts7 ,11, 13. Sa partikular, ang nailhan karon nga polymerase chain reaction (PCR)19 naglakip sa enzyme (Taq polymerase) nga nahimulag gikan sa thermophilic bacterium nga Thermus aquaticus, usa sa unang mga thermophile nga nadiskobrehan.
Bisan pa, ang pagtuon sa mga thermophile dili sayon nga buluhaton ug dili mahimo nga improvised sa bisan unsang biolohikal nga laboratoryo. Sa partikular, ang buhi nga mga thermophile dili maobserbahan sa vitro gamit ang bisan unsang standard light microscope, bisan pa nga adunay komersyal nga mga heating chamber, kasagaran gimarkahan alang sa temperatura nga ubos sa 40°C. Sukad sa 1990s, pipila ra ka grupo sa panukiduki ang nagpahinungod sa ilang kaugalingon sa pagpaila sa mga sistema sa high-temperature microscopy (HTM). Niadtong 1994 Glukh et al. Ang heating/cooling chamber gipanamkon base sa paggamit sa Peltier cell nga nagkontrol sa temperatura sa rectangular capillaries nga sirado aron mamentinar ang anaerobicity 20 . Ang aparato mahimong mapainit hangtod sa 100 °C sa rate nga 2 °C / s, nga gitugotan ang mga tagsulat nga tun-an ang paglihok sa hyperthermophilic bacterium nga Thermotoga maritima21. Niadtong 1999 Horn et al. Usa ka susama kaayo nga himan ang naugmad, gibase gihapon sa paggamit sa gipainit nga mga kapilarya nga angay alang sa komersyal nga mikroskopya sa pagtuon sa cell division/koneksyon. Human sa taas nga panahon sa paryente nga dili aktibo, ang pagpangita alang sa epektibo nga HTMs gipadayon sa 2012, ilabi na sa kalambigitan sa usa ka serye sa mga papeles sa Wirth nga grupo nga migamit sa usa ka himan nga giimbento ni Horn et al. Napulog lima ka tuig ang milabay, ang motility sa usa ka dako nga gidaghanon sa mga archaea, lakip na ang hyperthermophiles, gitun-an sa temperatura ngadto sa 100 ° C gamit ang gipainit nga mga capillaries23,24. Gibag-o usab nila ang orihinal nga mikroskopyo aron makab-ot ang mas paspas nga pagpainit (pila ka minuto imbis nga 35 minuto aron maabot ang gitakda nga temperatura) ug makab-ot ang usa ka linear nga gradient sa temperatura nga labaw sa 2 cm tabok sa medium. Kini nga temperature gradient shaping device (TGFD) gigamit sa pagtuon sa paglihok sa daghang mga thermophile sulod sa temperature gradients sa biologically relevant nga mga distansiya 24, 25 .
Ang pagpainit sa sirado nga mga capillary dili lamang ang paagi sa pag-obserbar sa mga buhi nga thermophile. Sa 2012, Kuwabara et al. Ang mga homemade disposable nga Pyrex nga mga lawak nga gisilyohan og heat-resistant adhesive (Super X2; Cemedine, Japan) gigamit. Ang mga sample gibutang sa usa ka komersyal nga magamit nga transparent heating plate (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) nga makahimo sa pagpainit hangtod sa 110 ° C, apan dili orihinal nga gituyo alang sa bioimaging. Naobserbahan sa mga tagsulat ang episyente nga pagbahin sa anaerobic thermophilic bacteria (Thermosipho globiformans, pagdoble nga oras 24 min) sa 65 °C. Sa 2020, Pulshen et al. Ang episyente nga pagpainit sa komersyal nga metal nga mga pinggan (AttofluorTM, Thermofisher) gipakita gamit ang duha ka homemade nga mga elemento sa pagpainit: usa ka taklob ug usa ka entablado (PCR machine-inspired configuration). Kini nga asosasyon moresulta sa usa ka uniporme nga likido nga temperatura ug magpugong sa evaporation ug condensation sa ubos sa tabon. Ang paggamit sa usa ka O-ring naglikay sa gas exchange sa palibot. Kini nga HTM, gitawag nga Sulfoscope, gigamit sa paglarawan sa Sulfolobus acidocaldarius sa 75°C27.
Usa ka giila nga limitasyon sa tanan niini nga mga sistema mao ang pagdili sa paggamit sa mga katuyoan sa hangin, bisan unsang pagpaunlod sa lana dili angay alang sa ingon ka taas nga temperatura ug alang sa pag-imaging pinaagi sa> 1-mm nga baga nga transparent nga mga sample. Usa ka giila nga limitasyon sa tanan niini nga mga sistema mao ang pagdili sa paggamit sa mga katuyoan sa hangin, bisan unsang pagpaunlod sa lana dili angay alang sa ingon ka taas nga temperatura ug alang sa pag-imaging pinaagi sa> 1-mm nga baga nga transparent nga mga sample. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколмькужов ение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщ1инмой. Ang usa ka giila nga kakulangan sa tanan niini nga mga sistema mao ang limitasyon sa paggamit sa mga katuyoan sa hangin, tungod kay ang bisan unsang pagpaunlod sa lana dili angay alang sa ingon ka taas nga temperatura ug alang sa pagtan-aw pinaagi sa transparent nga mga sample> 1 mm ang gibag-on.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的这合这样厚的透明样品成像。 Usa ka giila nga limitasyon sa tanan niini nga mga sistema mao ang limitasyon sa paggamit sa usa ka hangin-entrained salamin, tungod kay ang bisan unsa nga pagpaunlod sa lana dili angay alang sa imaging transparent samples> 1 mm gibag-on sa ingon ka taas nga temperatura. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, лимубовов масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Ang usa ka giila nga disbentaha sa tanan niini nga mga sistema mao ang limitado nga paggamit sa mga lente sa hangin, bisan unsang pagpaunlod sa lana dili angay alang sa ingon ka taas nga temperatura ug pagtan-aw pinaagi sa transparent nga mga sample> 1 mm ang gibag-on.Bag-ohay lang, kini nga limitasyon gitangtang ni Charles-Orzag et al. 28, nga nagpalambo sa usa ka aparato nga wala na maghatag kainit sa palibot sa sistema sa interes, apan sa sulod mismo sa tabon nga baso, gitabonan sa usa ka manipis nga transparent layer sa usa ka resistor nga hinimo sa ITO (indium-tin oxide). Ang tabon mahimong mapainit hangtod sa 75 °C pinaagi sa pagpasa sa usa ka koryente nga agianan sa transparent layer. Bisan pa, kinahanglan usab nga ipainit sa tagsulat ang lente sa katuyoan, apan dili molapas sa 65 °C, aron dili kini makadaot.
Kini nga mga buhat nagpakita nga ang pag-uswag sa episyente nga high-temperature optical microscopy wala pa kaylap nga gisagop, kasagaran nanginahanglan mga gamit sa balay, ug kanunay nga makab-ot sa kantidad sa spatial nga resolusyon, nga usa ka seryoso nga disbentaha nga gihatag nga ang mga thermophilic microorganism dili labi ka daghan kaysa pipila. micrometer. Ang pagkunhod sa gidaghanon sa pagpainit mao ang yawe sa pagsulbad sa tulo ka kinaiyanhong mga problema sa HTM: dili maayo nga spatial resolution, taas nga thermal inertia sa dihang ang sistema moinit, ug makadaot nga pagpainit sa mga elemento sa palibot (pagpaunlod sa lana, tumong nga lente ... o mga kamot sa tiggamit) sa grabeng temperatura. ).
Sa kini nga papel, gipaila namon ang usa ka HTM alang sa pag-obserbar sa thermophile nga wala gibase sa resistive nga pagpainit. Hinuon, nakab-ot namo ang lokal nga pagpainit sulod sa limitadong rehiyon sa natad sa panglantaw sa mikroskopyo pinaagi sa laser irradiation sa substrate nga mosuhop sa kahayag. Ang pag-apod-apod sa temperatura gitan-aw gamit ang quantitative phase microscopy (QPM). Ang pagka-epektibo niini nga pamaagi gipakita sa Geobacillus stearothermophilus, usa ka motile thermophilic bacterium nga mosanay sa mga 65°C ug adunay mubo nga oras sa pagdoble (mga 20 minutos), ug Sulfolobus shibatae, usa ka hyperthermophile nga motubo nga maayo sa 80°C (archaea) sa pag-ilustrar. Ang normal nga rate sa pagkopya ug paglangoy naobserbahan ingon usa ka function sa temperatura. Kini nga laser HTM (LA-HTM) dili limitado sa gibag-on sa coverslip o sa kinaiyahan sa katuyoan (pagpaunlod sa hangin o lana). Gitugotan niini ang bisan unsang taas nga resolusyon nga lente sa merkado nga magamit. Dili usab kini mag-antos sa hinay nga pagpainit tungod sa thermal inertia (makab-ot dayon nga pagpainit sa usa ka millisecond nga sukod) ug naggamit lamang sa mga sangkap nga magamit sa komersyo. Ang bugtong bag-ong kahingawa sa kahilwasan nalangkit sa presensya sa gamhanang mga laser beam (kasagaran hangtod sa 100 mW) sulod sa device ug posibleng pinaagi sa mga mata, nga nagkinahanglan ug protective goggles.
Ang prinsipyo sa LA-HTM mao ang paggamit sa usa ka laser sa pagpainit sa sample sa lokal sulod sa natad sa panglantaw sa mikroskopyo (Fig. 1a). Aron mahimo kini, ang sample kinahanglan nga mosuhop sa kahayag. Aron magamit ang usa ka makatarunganon nga gahum sa laser (dili moubos sa 100 mW), wala kami nagsalig sa pagsuyup sa kahayag sa medium nga likido, apan artipisyal nga gipadako ang pagsuyup sa sample pinaagi sa pagtabon sa substrate nga adunay mga nanopartikel nga bulawan (Fig. 1c). Ang pagpainit sa bulawan nga mga nanopartikel nga adunay kahayag adunay sukaranan nga importansya sa natad sa thermal plasmonics, nga adunay gipaabut nga aplikasyon sa biomedicine, nanochemistry o pag-ani sa adlaw29,30,31. Sa miaging pipila ka tuig, gigamit namo kini nga LA-HTM sa daghang mga pagtuon nga may kalabotan sa mga aplikasyon sa thermal plasma sa pisika, chemistry ug biology. Ang nag-unang kalisud niini nga pamaagi mao ang pagpakita sa katapusang profile sa temperatura, tungod kay ang taas nga temperatura limitado sa usa ka microscale nga rehiyon sulod sa sample. Gipakita namo nga ang pagmapa sa temperatura mahimong makab-ot gamit ang upat ka wavelength nga transverse shear interferometer, usa ka yano, taas nga resolusyon, ug sensitibo kaayo nga pamaagi sa quantitative phase microscopy base sa paggamit sa two-dimensional diffraction gratings (nailhan usab nga cross gratings) 33,34,35,36. Ang pagkakasaligan niining thermal microscopy technique, base sa crossed grating wavefront microscopy (CGM), gipakita sa usa ka dosena nga mga papel nga gipatik sa miaging dekada37,38,39,40,41,42,43.
Scheme sa pag-instalar sa parallel nga pagpainit sa laser, pagporma ug temperatura nga mikroskopyo. b Sample geometry nga naglangkob sa usa ka AttofluorTM chamber nga adunay sulod nga coverslip nga adunay sapaw nga bulawan nga nanoparticle. c Tan-awa pag-ayo ang sample (dili sa sukdanan). Ang d nagrepresentar sa uniporme nga profile sa laser beam ug (e) ang simulate nga sunud-sunod nga pag-apod-apod sa temperatura sa sample nga eroplano sa mga nanopartikel nga bulawan. f kay usa ka annular laser beam profile nga angay para sa pagmugna ug uniporme nga temperatura sama sa gipakita sa simulation sa resulta nga distribusyon sa temperatura nga gipakita sa (g). Scale bar: 30 µm.
Sa partikular, bag-ohay lang nga nakab-ot namon ang pagpainit sa mga selula sa mammalian nga adunay LA-HTM ug CGM ug gisubay ang mga tubag sa cellular heat shock sa sakup nga 37-42 ° C, nga nagpakita sa pagkagamit niini nga teknik sa usa ka buhi nga cell imaging. Bisan pa, ang paggamit sa LA-HTM sa pagtuon sa mga microorganism sa taas nga temperatura dili klaro, tungod kay kini nanginahanglan labi nga pag-amping kung itandi sa mga selula sa mammalian: una, ang pagpainit sa ilawom sa medium sa napulo ka degree (imbes pipila ka degree) nanguna. ngadto sa usa ka lig-on nga bertikal nga temperatura gradient. makahimo sa fluid convection 44 nga, kon dili hugot nga gilakip sa substrate, mahimong hinungdan sa dili maayo nga paglihok ug pagsagol sa bakterya. Kini nga convection mahimong mawagtang pinaagi sa pagkunhod sa gibag-on sa liquid layer. Alang niini nga katuyoan, sa tanan nga mga eksperimento nga gipresentar sa ubos, ang bacterial suspensions gibutang taliwala sa duha ka coverslips nga gibana-bana nga 15 µm ang gibag-on nga gibutang sa sulod sa usa ka metal nga tasa (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). Sa prinsipyo, ang kombeksyon mahimong malikayan kung ang gibag-on sa likido mas gamay kaysa sa gidak-on sa beam sa laser sa pagpainit. Ikaduha, ang pagtrabaho sa ingon ka limitado nga geometry makapahuyang sa mga aerobic nga organismo (tan-awa ang Fig. S2). Kini nga problema mahimong malikayan pinaagi sa paggamit sa usa ka substrate nga permeable sa oxygen (o sa bisan unsa nga lain nga importante nga gas), pinaagi sa pagbiya sa natanggong hangin bubbles sulod sa coverslip, o pinaagi sa drilling buslot sa ibabaw coverslip (tan-awa ang Fig. S1) 45 . Sa kini nga pagtuon, gipili namon ang ulahi nga solusyon (Mga numero 1b ug S1). Sa katapusan, ang pagpainit sa laser wala maghatag parehas nga pag-apod-apod sa temperatura. Bisan sa parehas nga intensity sa laser beam (Fig. 1d), ang pag-apod-apod sa temperatura dili parehas, apan susama sa pag-apod-apod sa Gaussian tungod sa thermal diffusion (Fig. 1e). Kung ang tumong mao ang pag-establisar sa tukma nga temperatura sa natad sa panglantaw alang sa pagtuon sa biological nga mga sistema, ang dili patas nga mga profile dili maayo ug mahimo usab nga mosangpot sa thermophoretic nga paglihok sa bakterya kon dili kini mosunod sa substrate (tan-awa ang Fig. S3, S4)39. Niini nga katuyoan, gigamit namon ang usa ka spatial light modulator (SLM) aron maporma ang infrared laser beam sumala sa porma sa singsing (Fig. 1f) sa eroplano sa sample aron makab-ot ang usa ka hingpit nga managsama nga pag-apod-apod sa temperatura sa sulod sa gihatag nga geometric nga lugar, bisan pa sa thermal diffusion (Fig. 1d) 39, 42, 46. Ibutang ang ibabaw nga coverslip ibabaw sa metal dish (Figure 1b) aron malikayan ang pag-alisngaw sa medium ug tan-awa sulod sa pipila ka adlaw. Tungod kay kini nga top coverslip dili selyado, ang dugang nga medium dali nga madugang bisan unsang oras kung kinahanglan.
Sa pag-ilustrar kung giunsa paglihok sa LA-HTM ug gipakita ang pagkagamit niini sa panukiduki nga thermophilic, among gitun-an ang aerobic bacteria nga Geobacillus stearothermophilus, nga adunay labing taas nga temperatura sa pagtubo sa mga 60-65°C. Ang bacterium usab adunay flagella ug ang abilidad sa paglangoy, nga naghatag og laing timailhan sa normal nga kalihokan sa selula.
Ang mga sample (Fig. 1b) gi-pre-incubated sa 60 ° C sulod sa usa ka oras ug dayon gibutang sa usa ka LA-HTM sample holder. Kini nga pre-incubation kay opsyonal, apan mapuslanon gihapon, tungod sa duha ka rason: Una, sa dihang ang laser gi-on, kini maoy hinungdan sa mga selula nga motubo dayon ug mabahin (tan-awa ang salida M1 sa Supplementary Materials). Kung wala ang pre-incubation, ang pagtubo sa bakterya kasagarang malangan sa mga 40 minuto matag higayon nga ang usa ka bag-ong lugar nga tan-awon gipainit sa sample. Ikaduha, ang 1 ka oras nga pre-incubation nagpasiugda sa pagdikit sa bakterya ngadto sa coverslip, nga nagpugong sa mga selula gikan sa pagkaanod gikan sa natad sa panglantaw tungod sa thermophoresis sa dihang ang laser gi-on (tan-awa ang pelikula nga M2 sa Supplementary Materials). Ang Thermophoresis mao ang paglihok sa mga partikulo o molekula subay sa gradient sa temperatura, kasagaran gikan sa init ngadto sa bugnaw, ug ang bakterya walay eksepsiyon43,47. Kini nga dili gusto nga epekto giwagtang sa usa ka gihatag nga lugar pinaagi sa paggamit sa SLM aron maporma ang laser beam ug makab-ot ang usa ka patag nga pag-apod-apod sa temperatura.
Sa fig. Gipakita sa Figure 2 ang pag-apod-apod sa temperatura nga gisukod sa CGM nga nakuha pinaagi sa pag-irradiate sa usa ka baso nga substrate nga adunay sapaw nga bulawan nga nanoparticle nga adunay annular laser beam (Fig. 1f). Ang usa ka patag nga pag-apod-apod sa temperatura naobserbahan sa tibuuk nga lugar nga nasakup sa laser beam. Kini nga sona gitakda sa 65°C, ang labing maayo nga temperatura sa pagtubo. Sa gawas niini nga rehiyon, ang kurba sa temperatura natural nga mahulog ngadto sa \(1/r\) (diin ang \(r\) mao ang radial coordinate).
usa ka Mapa sa temperatura sa mga pagsukod sa CGM nga nakuha pinaagi sa paggamit sa usa ka annular laser beam aron sa pag-irradiate sa usa ka layer sa bulawan nga nanoparticle aron makakuha usa ka patag nga profile sa temperatura sa usa ka lingin nga lugar. b Isotherm sa mapa sa temperatura (a). Ang contour sa laser beam girepresentahan sa usa ka gray nga tuldok nga lingin. Ang eksperimento gisubli kaduha (tan-awa ang Supplementary Materials, Figure S4).
Ang viability sa bacterial cells gimonitor sulod sa daghang oras gamit ang LA-HTM. Sa fig. Ang 3 nagpakita sa agwat sa oras alang sa upat ka mga hulagway nga gikuha gikan sa usa ka 3 ka oras 20 minutos nga salida (Movie M3, Supplementary Information). Ang mga bakterya naobserbahan nga aktibong midaghan sulod sa lingin nga dapit nga gihubit sa laser diin ang temperatura mao ang labing maayo, nga nagkaduol sa 65°C. Sa kasukwahi, ang pag-uswag sa selula mikunhod pag-ayo sa dihang ang temperatura nahulog ubos sa 50°C sulod sa 10 ka s.
Optical depth nga mga hulagway sa G. stearothermophilus bacteria nga nagtubo human sa pagpainit sa laser sa lain-laing mga panahon, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, gikan sa 200 Gikuha gikan sa usa ka minuto nga pelikula (M3 nga pelikula nga gihatag sa Supplementary Information) nga gipatong sa katugbang nga mapa sa temperatura. Ang laser mosiga sa oras \(t=0\). Ang mga isotherm gidugang sa intensity image.
Aron madugangan ang pag-ihap sa pagtubo sa selula ug ang pagdepende niini sa temperatura, among gisukod ang pagtaas sa biomass sa lainlaing mga kolonya sa una nga nahimulag nga bakterya sa natad sa pagtan-aw sa Movie M3 (Fig. 4). Ang ginikanan nga bakterya nga gipili sa pagsugod sa pagporma sa mini colony forming unit (mCFU) gipakita sa Figure S6. Ang uga nga mga pagsukod sa masa gikuha gamit ang CGM 48 camera nga gigamit sa pagmapa sa pag-apod-apod sa temperatura. Ang katakus sa CGM sa pagsukod sa uga nga gibug-aton ug temperatura mao ang kusog sa LA-HTM. Sama sa gipaabot, ang taas nga temperatura hinungdan sa mas paspas nga pagtubo sa bakterya (Fig. 4a). Sama sa gipakita sa semi-log plot sa Fig. 4b, ang pagtubo sa tanang temperatura nagsunod sa exponential nga pagtubo, diin ang datos naggamit sa exponential function \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), diin \(\tau {{{{{\rm{log}}}}}}}2\) – panahon sa henerasyon (o oras sa pagdoble), \(g =1/ \tau\) – gikusgon sa pagtubo (gidaghanon sa mga dibisyon kada yunit sa oras ). Sa fig. Gipakita sa 4c ang tagsa-tagsa nga rate sa pagtubo ug oras sa henerasyon isip function sa temperatura. Ang paspas nga nagtubo nga mCFUs gihulagway pinaagi sa saturation sa pagtubo pagkahuman sa duha ka oras, usa ka gipaabot nga pamatasan tungod sa taas nga density sa bakterya (susama sa naghunong nga yugto sa mga klasikal nga kultura nga likido). Ang kinatibuk-ang porma \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) katumbas sa gipaabot nga two-phase curve para sa G. stearothermophilus nga adunay labing maayo nga pagtubo sa palibot sa 60-65°C. Ipares ang datos gamit ang kardinal nga modelo (Figure S5)49 diin \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, nga nahiuyon pag-ayo sa ubang mga mithi nga gihisgotan sa literatura49. Bisan pa nga ang mga parameter nga nagsalig sa temperatura mabag-o, ang labing taas nga rate sa pagtubo sa \({G}_{0}\) mahimong magkalainlain gikan sa usa ka eksperimento ngadto sa lain (tan-awa ang mga numero S7-S9 ug salida M4). Sukwahi sa mga parameter nga angay sa temperatura, nga kinahanglan nga unibersal, ang labing taas nga rate sa pagtubo nagdepende sa mga kabtangan sa medium (pagkaanaa sa mga sustansya, konsentrasyon sa oxygen) sa sulod sa naobserbahan nga microscale geometry.
usa ka microbial nga pagtubo sa lain-laing mga temperatura. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Ang datos nga nakuha gikan sa usa ka video sa usa ka bacterium nga nagtubo sa temperatura nga gradient (movie M3). b Parehas sa (a), semi-logarithmic nga sukdanan. c Growth rate\(\tau\) ug generation time\(g\) kalkulado gikan sa linear regression (b). Horizontal error bars: temperatura range diin ang mga mCFUs gipalapad ngadto sa natad sa panglantaw sa panahon sa pagtubo. Vertical error bars: linear regression standard error.
Dugang sa normal nga pagtubo, ang pipila ka bakterya usahay molutaw sa pagtan-aw sa panahon sa pagpainit sa laser, nga usa ka gipaabot nga kinaiya alang sa bakterya nga adunay flagella. Ang salida nga M5 sa dugang nga impormasyon nagpakita sa maong mga kalihokan sa paglangoy. Niini nga eksperimento, ang uniporme nga laser radiation gigamit sa paghimo og temperatura nga gradient, sama sa gipakita sa Figures 1d, e ug S3. Gipakita sa Figure 5 ang duha ka han-ay sa imahe nga gipili gikan sa M5 nga salida nga nagpakita nga ang usa ka bakterya nagpakita sa direksyon nga paglihok samtang ang tanan nga ubang mga bakterya nagpabilin nga wala’y paglihok.
Ang duha ka time frame (a) ug (b) nagpakita sa paglangoy sa duha ka lain-laing bakterya nga gimarkahan og tuldok-tuldok nga mga lingin. Ang mga hulagway gikuha gikan sa M5 nga salida (gihatag isip supplementary material).
Sa kaso sa G. stearothermophilus, ang aktibong paglihok sa bakterya (Fig. 5) nagsugod pipila ka segundo human ang laser beam gi-on. Kini nga obserbasyon nagpasiugda sa temporal nga tubag niini nga thermophilic microorganism sa usa ka pagtaas sa temperatura, ingon sa naobserbahan sa Mora et al. 24 . Ang hilisgutan sa bacterial motility ug bisan ang thermotaxis mahimong dugang nga tukion gamit ang LA-HTM.
Ang paglangoy sa mikrobyo kinahanglan dili isagol sa ubang mga matang sa pisikal nga paglihok, nga mao ang (i) Brownian motion, nga makita nga gubot nga paglihok nga walay tino nga direksyon, (ii) convection 50 ug thermophoresis 43, nga naglangkob sa usa ka regular nga pag-anod sa paglihok sa usa ka temperatura. gradient.
Nailhan ang G. stearothermophilus tungod sa abilidad niini sa pagprodyus og highly resistant spores (spore formation) kon maladlad sa dili maayo nga kahimtang sa kinaiyahan isip depensa. Kung ang mga kahimtang sa kalikopan mahimong paborable pag-usab, ang mga spora moturok, nga mahimong buhi nga mga selyula ug magpadayon sa pagtubo. Bisan kung kini nga proseso sa sporulation/pagtubo nahibal-an, wala pa kini naobserbahan sa tinuud nga oras. Gamit ang LA-HTM, among gitaho dinhi ang unang obserbasyon sa mga panghitabo sa pagtubo sa G. stearothermophilus.
Sa fig. Ang 6a nagpakita sa time-lapse nga mga hulagway sa optical depth (OT) nga nakuha gamit ang CGM set sa 13 spores. Sa tibuok panahon sa pagkolekta (15 h 6 min, \(t=0\) – ang sinugdanan sa pagpainit sa laser), 4 sa 13 ka spora miturok, sa sunodsunod nga mga punto sa oras \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ug \(11\) h \(30\)'. Bisan kung usa ra sa kini nga mga panghitabo ang gipakita sa Figure 6, 4 nga mga panghitabo sa pagtubo mahimong maobserbahan sa M6 movie sa suplemento nga materyal. Makapainteres, ang pagturok morag sulagma: dili tanang spora moturok ug dili motubo sa samang higayon, bisan pa sa samang kausaban sa kahimtang sa kinaiyahan.
usa ka Time-lapse nga gilangkuban sa 8 ka OT nga mga hulagway (pagpaunlod sa lana, 60x, 1.25 NA nga tumong) ug (b) biomass evolution sa G. stearothermophilus aggregates. c (b) Gidrowing sa semi-log scale aron ipasiugda ang linearity sa growth rate (dashed line).
Sa fig. Ang 6b, c nagpakita sa biomass sa mga populasyon sa selula sa natad sa panglantaw isip usa ka function sa panahon sa tibuok nga panahon sa pagkolekta sa datos. Ang paspas nga pagkadunot sa uga nga masa nga nakita sa \(t=5\)h sa fig. 6b, c, tungod sa paggawas sa pipila ka mga selyula gikan sa natad sa pagtan-aw. Ang gikusgon sa pagtubo niining upat ka panghitabo mao ang \(0.77\pm 0.1\) h-1. Kini nga bili mas taas kay sa pagtubo nga may kalabutan sa Figure 3. 3 ug 4, diin ang mga selula motubo nga normal. Ang hinungdan sa pagtaas sa rate sa pagtubo sa G. stearothermophilus gikan sa mga spores dili klaro, apan kini nga mga pagsukod nagpasiugda sa interes sa LA-HTM ug nagtrabaho sa usa ka lebel sa cell (o sa usa ka lebel sa mCFU) aron mahibal-an ang dugang bahin sa dinamika sa kinabuhi sa cell. .
Aron dugang nga ipakita ang versatility sa LA-HTM ug ang performance niini sa taas nga temperatura, among gisusi ang pagtubo sa Sulfolobus shibatae, usa ka hyperthermophilic acidophilic archaea nga adunay labing taas nga temperatura sa pagtubo nga 80°C51. Kon itandi sa G. stearothermophilus, kini nga mga archaea usab adunay lahi kaayo nga morpolohiya, nga susama sa 1 ka micron spheres (cocci) kay sa mga elongated rods (bacilli).
Ang Figure 7a naglangkob sa sequential optical depth nga mga hulagway sa S. shibatae mCFU nga nakuha gamit ang CGM (tan-awa ang M7 feature film sa Supplementary Materials). Kini nga mCFU motubo sa palibot sa 73°C, ubos sa labing taas nga temperatura nga 80°C, apan sulod sa sakup sa temperatura alang sa aktibong pagtubo. Naobserbahan namon ang daghang mga panghitabo sa fission nga naghimo sa mga mCFU nga morag micrograpes sa archaea pagkahuman sa pipila ka oras. Gikan niining mga OT nga mga hulagway, ang mCFU biomass gisukod sa paglabay sa panahon ug gipresentar sa Figure 7b. Makaiikag, ang S. shibatae mCFUs nagpakita sa linear nga pagtubo kaysa sa exponential nga pagtubo nga nakita sa G. stearothermophilus mCFUs. Adunay dugay na nga diskusyon 52 mahitungod sa kinaiya sa mga rate sa pagtubo sa selula: samtang ang pipila ka mga pagtuon nagtaho sa mga rate sa pagtubo sa mga mikrobyo nga proporsyonal sa ilang gidak-on (exponential growth), ang uban nagpakita sa usa ka kanunay nga rate (linear o bilinear nga pagtubo). Sumala sa gipatin-aw ni Tzur et al.53, ang pag-ila tali sa exponential ug (bi) linear nga pagtubo nagkinahanglan og tukma nga <6% sa biomass measurements, nga dili maabot sa kadaghanan sa mga teknik sa QPM, bisan pa nga naglambigit sa interferometry. Sumala sa gipatin-aw ni Tzur et al.53, ang pag-ila tali sa exponential ug (bi) linear nga pagtubo nagkinahanglan og tukma nga <6% sa biomass measurements, nga dili maabot sa kadaghanan sa mga teknik sa QPM, bisan pa nga naglambigit sa interferometry. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в избеиостих для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Sumala sa gipatin-aw ni Zur et al.53, ang pag-ila tali sa exponential ug (bi) linear nga pagtubo nagkinahanglan og <6% nga katukma sa biomass measurements, nga dili makab-ot sa kadaghanan sa mga pamaagi sa QPM, bisan sa paggamit sa interferometry.Sama sa gipatin-aw ni Zur et al. 53, ang pag-ila tali sa exponential ug (bi) linear nga pagtubo nanginahanglan ubos sa 6% nga katukma sa mga pagsukod sa biomass, nga dili makab-ot sa kadaghanan nga mga pamaagi sa QPM, bisan kung gigamit ang interferometry. Nakab-ot sa CGM kini nga katukma nga adunay katukma sa sub-pg sa mga pagsukod sa biomass36,48.
usa ka Time-lapse nga gilangkuban sa 6 ka OT nga mga imahe (pagpaunlod sa lana, 60x, katuyoan sa NA 1.25) ug (b) micro-CFU biomass evolution nga gisukod sa CGM. Tan-awa ang salida M7 para sa dugang nga impormasyon.
Ang hingpit nga linear nga pagtubo sa S. shibatae wala damha ug wala pa gitaho. Bisan pa, ang pagpalapad nga pagtubo gilauman, labing menos tungod kay sa paglabay sa panahon, daghang mga dibisyon sa 2, 4, 8, 16 ... nga mga selyula kinahanglan mahitabo. Gipanghimatuud namon nga ang linear nga pagtubo mahimo’g tungod sa pagdili sa cell tungod sa dasok nga pagputos sa cell, sama nga ang pagtubo sa cell hinay ug sa katapusan moabut sa usa ka dormant nga kahimtang kung ang densidad sa cell taas kaayo.
Gitapos namon pinaagi sa paghisgot sa mosunod nga lima ka punto sa interes sa baylo: pagkunhod sa gidaghanon sa pagpainit, pagkunhod sa thermal inertia, interes sa bulawan nga nanoparticle, interes sa quantitative phase microscopy, ug usa ka posible nga range sa temperatura diin magamit ang LA-HTM.
Kung itandi sa resistive nga pagpainit, ang pagpainit sa laser nga gigamit alang sa pag-uswag sa HTM nagtanyag daghang mga bentaha, nga among gihulagway sa kini nga pagtuon. Sa partikular, sa likido nga media sa natad sa pagtan-aw sa mikroskopyo, ang gidaghanon sa pagpainit gitipigan sulod sa pipila (10 μm) 3 nga mga volume. Niining paagiha, ang mga naobserbahan nga mikrobyo lamang ang aktibo, samtang ang ubang mga bakterya natulog ug mahimong magamit sa dugang nga pagtuon sa sample - dili kinahanglan nga usbon ang sample sa matag higayon nga kinahanglan nga susihon ang bag-ong temperatura. Dugang pa, ang microscale nga pagpainit nagtugot sa direkta nga pagsusi sa daghang mga temperatura: Ang Figure 4c nakuha gikan sa usa ka 3-oras nga salida (Movie M3), nga kasagaran nagkinahanglan sa pag-andam ug pagsusi sa daghang mga sample - usa alang sa matag sample nga gitun-an. y ang temperatura nga nagrepresentar sa gidaghanon sa mga adlaw sa eksperimento. Ang pagkunhod sa gipainit nga volume nagpugong usab sa tanan nga naglibot nga optical nga mga sangkap sa mikroskopyo, labi na ang katuyoan nga lente, sa temperatura sa kwarto, nga usa ka dakong problema nga giatubang sa komunidad hangtod karon. Ang LA-HTM mahimong magamit sa bisan unsang lente, lakip ang mga lente sa pagpaunlod sa lana, ug magpabilin sa temperatura sa kwarto bisan kung adunay grabe nga temperatura sa natad sa pagtan-aw. Ang panguna nga limitasyon sa pamaagi sa pagpainit sa laser nga among gitaho sa kini nga pagtuon mao nga ang mga selyula nga dili mosunod o molutaw mahimong layo sa natad sa pagtan-aw ug lisud tun-an. Ang usa ka workaround mao ang paggamit sa mubu nga mga lente sa pagpadako aron makab-ot ang mas dako nga pagtaas sa temperatura nga sobra sa pipila ka gatos ka microns. Kini nga pag-amping giubanan sa pagkunhod sa resolusyon sa spatial, apan kung ang katuyoan mao ang pagtuon sa paglihok sa mga microorganism, dili kinahanglan ang taas nga resolusyon sa spatial.
Ang sukod sa oras alang sa pagpainit (ug pagpabugnaw) sa sistema \({{{{{\rm{\tau}}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) nagdepende sa gidak-on niini , sumala sa balaod \({{{({\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), diin \ (L\ ) mao ang kinaiya nga gidak-on sa init nga tinubdan (ang diametro sa laser beam sa atong pagtuon mao ang \(L\ mga 100\) μm), \(D\) mao ang thermal diffusivity sa palibot (average sa atong kaso, baso ug tubig Ang rate sa pagsabwag\(D\ mga 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Busa, niini nga pagtuon, ang mga tubag sa oras sa han-ay nga 50 ms, ie, quasi-instantaneous). Ang mga pagbag-o sa temperatura, mahimong mapaabut nga kini nga dali nga pag-establisar sa pagtaas sa temperatura dili lamang nagpamubo sa gidugayon sa eksperimento, apan gitugotan usab ang tukma nga oras \(t=0 \) alang sa bisan unsang dinamikong pagtuon sa mga epekto sa temperatura.
Ang among gisugyot nga pamaagi magamit sa bisan unsang substrate nga mosuhop sa kahayag (pananglitan, komersyal nga mga sample nga adunay ITO coating). Bisan pa, ang mga nanopartikel nga bulawan makahimo sa paghatag og taas nga pagsuyup sa infrared ug ubos nga pagsuyup sa makita nga range, ang ulahi nga mga kinaiya nga interesado alang sa epektibo nga optical observation sa makita nga range, labi na kung gigamit ang fluorescence. Dugang pa, ang bulawan biocompatible, chemically inert, optical density mahimong ipasibo gikan sa 530 nm ngadto sa duol sa infrared, ug ang pag-andam sa sample yano ug ekonomikanhon29.
Ang transverse grating wavefront microscopy (CGM) nagtugot dili lamang sa pagmapa sa temperatura sa microscale, kondili usab sa pagmonitor sa biomass, nga labi nga mapuslanon (kon dili kinahanglan) inubanan sa LA-HTM. Sa milabay nga dekada, ang ubang mga teknik sa mikroskopya sa temperatura naugmad, ilabina sa natad sa bioimaging, ug kadaghanan niini nagkinahanglan sa paggamit sa sensitibo sa temperatura nga fluorescent probes54,55. Bisan pa, kini nga mga pamaagi gisaway ug ang pipila nga mga taho nagsukod sa dili realistiko nga mga pagbag-o sa temperatura sa sulod sa mga selyula, lagmit tungod sa kamatuoran nga ang fluorescence nagdepende sa daghang mga hinungdan gawas sa temperatura. Dugang pa, kadaghanan sa mga fluorescent probe dili lig-on sa taas nga temperatura. Busa, ang QPM ug sa partikular nga CGM nagrepresentar sa usa ka sulundon nga temperatura nga mikroskopya nga teknik alang sa pagtuon sa kinabuhi sa taas nga temperatura gamit ang optical microscopy.
Ang mga pagtuon sa S. shibatae, nga nagkinabuhi nga maayo sa 80°C, nagpakita nga ang LA-HTM mahimong magamit sa pagtuon sa mga hyperthermophile, dili lamang sa yano nga mga thermophile. Sa prinsipyo, walay limitasyon sa range sa mga temperatura nga maabot gamit ang LA-HTM, ug bisan ang temperatura nga labaw sa 100°C mahimong maabot sa atmospheric pressure nga walay pagpabukal, ingon sa gipakita sa among grupo sa 38 sa hydrothermal chemistry applications sa atmospheric pressure A. Ang usa ka laser gigamit alang sa pagpainit sa bulawan nanoparticle 40 sa samang paagi. Sa ingon, ang LA-HTM adunay potensyal nga magamit sa pag-obserbar sa wala pa nakit-an nga hyperthermophiles nga adunay standard nga high resolution nga optical microscopy ubos sa standard nga kondisyon (ie ubos sa stress sa kinaiyahan).
Ang tanan nga mga eksperimento gihimo gamit ang usa ka homemade microscope, lakip ang Köhler illumination (uban ang LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), specimen holder nga adunay manual xy movement, mga katuyoan (Olympus, 60x, 0.7 NA, hangin, LUCPlanFLN60X o 60x, 1.25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), CGM camera (QLSI cross grating, 39 µm pitch, 0.87 mm gikan sa Andor Zyla camera sensor) aron makahatag og intensity ug wavefront imaging, ug sCMOS camera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit mode , gikan sa Hamamatsu) aron irekord ang data nga gipakita sa Figure 5 (bacterial swimming). Ang dichroic beam splitter usa ka 749 nm BrightLine edge (Semrock, FF749-SDi01). Ang filter sa atubangan sa camera usa ka 694 short pass filter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium sapphire laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumped tsunami laser cavity, Spectra-Physics sa Fig. 2-5, dugang gipulihan sa Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumped Mira laser cavity, Coherent, alang sa Fig. 2 -5). 6 ug 7) gitakda sa wavelength \({{{({\rm{\lambda }}}}}}}=800\) nm, nga katumbas sa plasmon resonance spectrum sa gold nanoparticles. Spatial light modulators (1920 × 1152 pixels) gipalit gikan sa Meadowlark Optics Ang mga holograms gikalkulo gamit ang Gerchberg-Saxton algorithm nga gihulagway sa link.
Ang cross grating wavefront microscopy (CGM) maoy usa ka optical microscopy nga teknik base sa pagkombinar sa duha ka dimensiyon nga diffraction grating (nailhan usab nga cross grating) sa gilay-on nga usa ka milimetro gikan sa usa ka conventional camera's sensor. Ang labing kasagaran nga pananglitan sa usa ka CGM nga among gigamit niini nga pagtuon gitawag nga upat ka wavelength transverse shift interferometer (QLSI), diin ang cross-grating naglangkob sa usa ka intensity/phase checkerboard pattern nga gipaila ug gi-patent ni Primot et al. sa 200034. Ang bertikal ug pinahigda nga mga linya sa grating nagmugna og grid-sama sa mga anino sa sensor, ang pagtuis niini mahimong maproseso sa numero sa tinuod nga panahon aron makuha ang optical wavefront distortion (o katumbas nga phase profile) sa insidente nga kahayag. Kung gigamit sa usa ka mikroskopyo, ang usa ka CGM camera mahimong magpakita sa kalainan sa optical path sa usa ka imahe nga butang, nailhan usab nga optical depth (OT), nga adunay pagkasensitibo sa han-ay sa nanometer36. Sa bisan unsang pagsukod sa CGM, aron mawagtang ang bisan unsang mga depekto sa optical nga mga sangkap o mga sagbayan, usa ka panguna nga reference nga imahe sa OT kinahanglan nga kuhaon ug ibawas gikan sa bisan unsang sunod nga mga imahe.
Ang mikroskopyo sa temperatura gihimo gamit ang CGM camera nga gihulagway sa reference. 32. Sa laktud, ang pagpainit sa usa ka likido nagbag-o sa iyang refractive index, nga nagmugna og usa ka thermal lens nga epekto nga nagtuis sa insidente nga sinag. Kini nga wavefront distortion gisukod sa CGM ug giproseso gamit ang deconvolution algorithm aron makakuha og three-dimensional temperature distribution sa liquid medium. Kung ang mga nanopartikel nga bulawan parehas nga giapod-apod sa tibuuk nga sample, ang pagmapa sa temperatura mahimo’g himuon sa mga lugar nga wala’y bakterya aron makahimo og mas maayo nga mga imahe, nga mao ang usahay naton buhaton. Ang reference nga CGM nga imahe nakuha nga walay pagpainit (nga ang laser off) ug pagkahuman nakuha sa parehas nga lokasyon sa imahe nga adunay laser.
Ang uga nga pagsukod sa masa makab-ot gamit ang parehas nga CGM camera nga gigamit alang sa temperatura imaging. Ang CGM reference nga mga hulagway nakuha pinaagi sa paspas nga paglihok sa sample sa x ug y atol sa exposure isip usa ka paagi sa pag-aberids sa bisan unsa nga inhomogeneity sa OT tungod sa presensya sa bakterya. Gikan sa OT nga mga imahe sa bakterya, ang ilang biomass nakuha gamit ang usa ka grupo sa mga imahe sa mga lugar nga gipili gamit ang homemade segmentation algorithm sa Matlab (tan-awa ang subseksyon nga "Numerical code"), pagsunod sa pamaagi nga gihulagway sa ref. 48. Sa laktod, atong gamiton ang relasyon nga \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}}y\), diin ang \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) mao ang optical depth image, \(m\) kay ang uga nga gibug-aton ug \({{{{\rm{\alpha}}}}}}}\) maoy usa ka makanunayon. Among gipili ang \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, nga maoy kasagarang kanunay alang sa buhing mga selula.
Usa ka tabon nga slip nga 25 mm ang diyametro ug 150 µm ang gibag-on nga adunay sapaw nga bulawan nga nanoparticle ang gibutang sa usa ka AttofluorTM chamber (Thermofisher) nga ang bulawan nga nanoparticle nag-atubang. Ang Geobacillus stearothermophilus gi-preculture sa tibuok gabii sa LB medium (200 rpm, 60°C) sa wala pa ang matag adlaw sa mga eksperimento. Usa ka tinulo sa 5 µl sa usa ka suspension sa G. stearothermophilus uban sa usa ka optical density (OD) sa 0.3 ngadto sa 0.5 gibutang sa usa ka tabon slip uban sa bulawan nanoparticle. Dayon, ang usa ka lingin nga tabon nga slip nga 18 mm ang diyametro nga adunay usa ka lungag nga 5 mm ang diyametro sa tunga gihulog sa tinulo, ug ang 5 μl nga bacterial suspension nga adunay parehas nga optical density gibalik-balik nga gigamit sa sentro sa lungag. Ang mga atabay sa mga coverlip giandam sumala sa pamaagi nga gihulagway sa ref. 45 (tan-awa ang Supplementary Information para sa dugang nga impormasyon). Dayon idugang ang 1 ml nga LB medium sa coverslip aron dili mamala ang liquid layer. Ang kataposang coverslip gibutang ibabaw sa sirado nga taklob sa Attofluor™ chamber aron mapugngan ang pag-alisngaw sa medium sa panahon sa paglumlum. Alang sa mga eksperimento sa pagtubo, gigamit namon ang mga spores, nga, pagkahuman sa naandan nga mga eksperimento, usahay gitabonan ang ibabaw nga coverslip. Ang susamang paagi gigamit aron makuha ang Sulfolobus shibatae. Tulo ka adlaw (200 rpm, 75 ° C) sa pasiuna nga pagtikad sa Thiobacillus serrata gihimo sa medium 182 (DSMZ).
Ang mga sample sa bulawan nga nanoparticle giandam sa micellar block copolymer lithography. Kini nga proseso gihulagway sa detalye sa Chap. 60. Sa makadiyot, ang mga micelles nga nag-encapsulate sa mga gold ions gi-synthesize pinaagi sa pagsagol sa copolymer sa HAuCl4 sa toluene. Ang gilimpyohan nga mga coverlips dayon gituslob sa solusyon ug gitambalan sa UV irradiation sa presensya sa usa ka reducing agent aron makakuha og bulawan nga mga liso. Sa katapusan, ang mga liso sa bulawan gipatubo pinaagi sa pagkontak sa usa ka coverslip nga adunay tubig nga solusyon sa KAuCl4 ug ethanolamine sulod sa 16 ka minuto, nga miresulta sa usa ka quasi-periodic ug parehas kaayo nga kahikayan sa non-spherical gold nanoparticle sa duol nga infrared.
Aron mabag-o ang mga interferograms sa mga imahe sa OT, gigamit namon ang usa ka algorithm nga hinimo sa balay, ingon nga detalyado sa link. 33 ug magamit isip usa ka Matlab nga pakete sa mosunod nga publikong repositoryo: https://github.com/baffou/CGMprocess. Mahimong kuwentahon sa package ang intensity ug OT nga mga imahe base sa narekord nga mga interferograms (lakip ang reference nga mga hulagway) ug mga distansya sa camera array.
Aron makalkulo ang hugna nga pattern nga gipadapat sa SLM aron makakuha ug gihatag nga temperatura nga profile, gigamit namo ang usa ka kanhi naugmad nga homemade algorithm39,42 nga anaa sa mosunod nga public repository: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ang input mao ang gitinguha nga natad sa temperatura, nga mahimong itakda sa digital o pinaagi sa usa ka monochrome bmp nga imahe.
Aron mabahin ang mga selyula ug sukdon ang ilang uga nga gibug-aton, gigamit namon ang among Matlab algorithm nga gipatik sa mosunod nga publiko nga repository: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Sa matag imahe, ang tiggamit kinahanglan nga mag-klik sa bakterya o mCFU nga interes, i-adjust ang pagkasensitibo sa wand, ug kumpirmahi ang pagpili.
Alang sa dugang nga kasayuran sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang abstract sa Nature Research Report nga nalambigit niini nga artikulo.
Ang mga datos nga nagsuporta sa mga resulta niini nga pagtuon anaa gikan sa tagsa-tagsa nga mga tagsulat sa makatarunganon nga hangyo.
Ang source code nga gigamit niini nga pagtuon detalyado sa Methods section, ug ang debug versions mahimong ma-download gikan sa https://github.com/baffou/ sa mosunod nga mga repository: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, ug CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sa mga thermophile ug sa ilang lapad nga spectrum nga mga aplikasyon. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight sa mga thermophile ug sa ilang lapad nga spectrum nga mga aplikasyon.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ug Sharma, AK Overview sa thermophiles ug sa ilang halapad nga aplikasyon. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ug Sharma AK Usa ka lawom nga pagsabut sa mga thermophile ug usa ka halapad nga aplikasyon.3 Bioteknolohiya 6, 81 (2016).
Oras sa pag-post: Sep-26-2022